[發明專利]一種篩選組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選方法

在審

• 申請號: 201310421010.8
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN104458668A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 嚴明;張陸勇;胡潔;高鵬
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于藥理學領域，利用熒光檢測技術，構建了組織蛋白酶B抑制劑的高通量篩選模型，用于待測樣品對組織蛋白酶B抑制活性的高通量檢測。

背景技術

組織蛋白酶(cathepsin)在各種動物組織的細胞內(特別是溶酶體部分)發現的一類蛋白酶。組織蛋白酶B催化苯甲酰-L-精氨酰胺的水解。其活性的表現需要巰基化合物(SH化合物)的存在，最適pH在6附近。近年來研究表明組織蛋白酶B是細胞溶酶體內的一種半胱氨酸蛋白酶，其可分布于腫瘤細胞的胞漿內，可降解層連蛋白、纖連蛋白、VI型膠原等細胞外基質成分，并可促進腫瘤血管的形成，是惡性腫瘤侵襲轉移的關鍵酶之一。因此組織蛋白酶B是癌癥治療的新的靶點，其抑制劑可能對改善預后，延長生存期有幫助。本方法目的為建立組織蛋白酶B抑制劑快速準確的篩選模型，并且可以在大量未知化合物中尋找到先導化合物，從而節省過多試劑消耗，運用在高通量篩選中。

發明內容

本發明的目的在于建立一種基于熒光的組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。

本發明的技術方案：采用熒光方法建立體外組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選模型，初篩，復篩發現一類具有抑制組織蛋白酶B活性的候選化合物。具體步驟如下：

本發明利用熒光的方法建立了一種組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選模型。

步驟一：組織蛋白酶B抑制劑篩選模型的建立與優化。

步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。

步驟三：高通量篩選模型驗證。

附圖說明：

圖1：組織蛋白酶B濃度梯度優化實驗結果。

圖2：組織蛋白酶B溫孵時間優化實驗結果。

圖3：陽性藥對組織蛋白酶B的抑制曲線圖。

圖4：高通量篩選Z′值分布。

具體實施方式

以下結合附圖說明本發明的具體實施方式：

1.組織蛋白酶B抑制劑篩選方法建立

(1)實驗材料

CathepsinB(Germany)、Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin?hydrochloride(Arg-Arg-7-AMC)、L-Cysteine?hydrochloride?monohydrate?reagent?grade(L-cys)、30％Brij?L23、亮抑酶肽(leupetin)、EDTA(USA)、去離子水，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀和其它化學試劑均為國產分析純、384孔黑板(Coming，USA)、槍頭(Axygen，USA)

(2)實驗步驟

(1)最適酶濃度與反應時間確定

a.用1×緩沖液配制足量濃度為8mM的L-cys工作溶液，每孔加27μl。

b.用0.1％Brij?L23配制不同濃度的2.5×CathepsinB工作液，每孔加入36μl，使CathepsinB的終濃度為1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0μg/ml。

c.用0.1％Brij?L23稀釋底物母液，至濃度為3.33μM的工作液。每孔27μl，快速加入。檢測12min內，Ex348nM，Em440nM處的熒光強度，反應溫度為40℃。對結果作圖，選取窗口大，酶用量小，并且反應時間較短的CathepsinB濃度為最適濃度，并選取能夠達到最大信號值80％的時間為反應時間。

(2)陽性藥IC50檢測

a.用1×緩沖液配制足量含有2.4mM?L-cys的緩沖液，用此緩沖液梯度稀釋陽性藥Leupetin，每孔加入27μl。

b.用0.1％Brij?L23配制2.5×CathepsinB工作液，每孔加入36μl，使其終濃度為1μg/ml；同樣配制濃度為3.33μM的底物工作液，每孔27μl，快速加入。

c.檢測10min時，Ex348nM，Em440nM處的熒光強度，反應溫度為40℃。計算Leupetin?IC50。

2.數據處理

(1)根據公式計算各孔的相對抑制率

(3)活性樣品進行濃度稀釋后檢測的相對抑制率值，使用作Graphpad軟件作圖求算半數抑制率IC₅₀。

實驗結果

組織蛋白酶B篩選模型優化結果：最佳反應所需的組織蛋白酶B為0.5μg/ml(見圖1)，最佳反應時間為10min(見圖2)，陽性藥半數抑制率IC₅₀為11.9nM(見圖3)，并通過Z’值(見圖4)驗證表明采用本方法建立的組織蛋白酶B抑制劑體外篩選模型達到了高通量篩選的要求，實驗結果穩定可靠，可以用于進行組織蛋白酶B抑制劑的高通量篩選。