[發(fā)明專利]一種篩選組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310421010.8
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN104458668A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 嚴明;張陸勇;胡潔;高鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選模型，其特征在于，包括步驟：

(1)蛋白酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化；

(2)陽性藥驗證模型可靠性；

(3)高通量篩選模型驗證。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶為組織蛋白酶B。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中進行確定最適酶濃度與反應(yīng)時間的實驗。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，用1×緩沖液配制足量濃度為8mM的L-cys工作溶液，每孔加27μl，用0.1％Brij?L23配制不同濃度的2.5×組織蛋白酶B工作液，每孔加入36μl，使組織蛋白酶B的終濃度為1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0μg/ml，用0.1％Brij?L23稀釋底物母液，至濃度為3.33μl?M的工作液，每孔27μl，快速加入，檢測12min內(nèi)，Ex348nM，Em440nM處的熒光強度，反應(yīng)溫度為40℃，對結(jié)果作圖，選取窗口大，酶用量小，并且反應(yīng)時間較短的組織蛋白酶B濃度為最適濃度，并選取能夠達到最大信號值80％的時間為反應(yīng)時間。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)選用步驟(1)所到的組織蛋白酶B濃度為最適濃度為0.5μg/ml，最佳反應(yīng)時間為10min，用1×緩沖液配制足量含有2.4mM?L-cys的緩沖液，用緩沖液梯度稀釋陽性藥亮抑酶肽，每孔加入27μl，用0.1％Brij?L23配制2.5×組織蛋白酶B工作液，每孔加入36μl，使其終濃度為1μg/ml；同樣配制濃度為3.33μM的底物工作液，每孔27μl，快速加入，檢測10min時，Ex348nM，Em440nM處的熒光強度，反應(yīng)溫度為40℃。計算陽性藥亮抑酶肽IC₅₀為11.9nM。

6.權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在篩選組織蛋白酶B抑制劑的應(yīng)用。