[發明專利]一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片及其制備方法

有效

• 申請號: 201310420276.0
• 申請日: 2013-09-16
• 公開（公告）號: CN103454412A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 程愛陽
• 申請（專利權）人: 南京博敏達生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林;劉艷艷

技術領域

本發明屬于生物醫藥類免疫化學領域，涉及一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片及其制備方法。

背景技術

過敏是一種常見病，世界衛生組織的數據表明，20-40%的人都曾罹患過敏性疾病。它是由過敏原（或稱變應原）誘發，并由結合于肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的IgE抗體所介導的變態反應，即所謂的Ⅰ型變態反應。過敏原是一些外源性蛋白質，在進入人體后可以與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上表面的IgE抗體結合，并引起過敏反應。

過敏診斷包括臨床病史、皮膚試驗和過敏原特異性IgE檢測三部分，只有在三者一致的情況下，才能確診。過敏原特異性IgE抗體檢測，又稱為體外過敏原檢測，其目的是了解血液中針對某一特定過敏原的IgE抗體含量，從而推斷患者體內的相關細胞是否可以與該過敏原結合，以便于過敏性疾病的診斷和治療。

目前廣為接受的過敏原特異性IgE抗體檢測方法均采用“夾心法”，其檢測流程和基本原理為：首先，將過敏原與固相支持物結合；之后，將患者血清樣品與固相支持物孵育，樣品中的過敏原特異性IgE抗體與固相支持物上的過敏原結合，形成“過敏原-IgE”復合物；然后，與攜帶有抗IgE抗體的報告分子孵育，形成“過敏原-IgE-報告分子”夾心復合物；最后，通過測量報告分子得到固相支持物上IgE的含量。

根據固相支持物和報告分子的不同，過敏原特異性IgE抗體檢測的方法可以分成三類：（1）ImmunoCAP法，由瑞典的Phadia公司開發，使用纖維素衍生物為固相支持物，具有過敏原種類多，結果準確的優點，也是過敏原特異性IgE檢測的金標準，不過價格相對昂貴；（2）酶聯免疫法或化學發光法，通常采用酶標微孔板為固相支持物，報告分子分別為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，也是最常見的方法；以及（3）免疫印跡法及蛋白質芯片法是將過敏原吸附到膜或玻璃上，通過過敏原在固相支持物上不同的位置來區分不同種的過敏原。方法（1）和（2）可以進行定量或半定量地檢測過敏原特異性IgE抗體，但是它們主要的技術缺點是每次反應只能檢測一種指標，并且使用血清樣品量較大。而方法（3），雖然理論上一次可以檢測多個指標，但是免疫化學反應發生在固相-液相之間，重復性差，靈敏度低，結果不穩定，只能進行定性檢測，并且使用樣品量大。

在體內除了IgE抗體，IgG4抗體也可以特異性地結合過敏原。IgG4抗體在人IgG抗體的四個亞型中含量最低，通常只占IgG抗體總數的6%左右。與其它的IgG亞型相比較，IgG4誘導補體能力和細胞活化性偏低，因此過敏原特異性IgG4抗體具有免疫調節功能，對過敏原特異性IgG4抗體進行檢測也具有重要的臨床意義。

過敏原的種類繁多，已知的過敏原超過兩萬種；最常見的過敏原就有六十多種，可以大致分為：（1）食物類過敏原，包括肉蛋奶、糧食和水果等；以及（2）吸入類或接觸類過敏原，包括花粉、動物皮毛、昆蟲、霉菌孢子等。由于過敏原種類繁多，過敏的確診比較困難，所以理想的體外過敏原檢測應當具有篩查性質，即對十幾種或幾十種過敏原進行系統性篩查，這樣才能有助于疾病的確診。但是通常的過敏原特異性IgE抗體檢測方法，例如ImmunoCAP法、酶聯免疫法和化學發光法，每次反應只能獲得一個指標；如果要檢測多個指標，則需要多個反應來完成，不僅浪費時間與勞動力，同時消耗了大量的樣品與試劑，檢測成本相對較高。因此，從醫療需求看，體外過敏原檢測迫切需要采用多重檢測技術，也就是每個檢測反應，可以同時檢測多個指標，從而降低成本，省力，省時。

液相芯片技術（或稱xMAP技術）是由美國Luminex公司開發的一種多功能多重檢測技術平臺，可以對生物分子進行高通量、多重檢測。液相芯片技術中，固相支持物是帶有熒光物質編碼的羧基化聚苯乙烯微球，根據平臺的不同，微球分別有100種（雙色編碼）或500種（三色編碼）。使用時，首先將微球與相關生物分子進行化學偶聯獲得探針；檢測時，將探針與待測物反應。反應產物通過液相芯片儀的檢測通道，使用不同波長的激光分別讀取微球的編碼以及待測樣本上的報告分子（藻紅蛋白），實現對樣品中待測分子的定量分析。同經典的免疫化學方法相比較，液相芯片法有三點優勢：（1）使用微米直徑的微球，將免疫化學反應體系由傳統的液相-固相反應改變為接近生物系統內部環境的液相反應體系，具有反應速度快、重復性好、靈敏度高的優點；（2）多個指標的并行檢測，可以同時檢測數百個指標；由于常見的過敏原有六十余種，該技術適合于體外過敏原篩查；以及（3）使用樣本少，每次反應只需要數十微升的血清。

發明內容