[發明專利]一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片及其制備方法

有效

• 申請號: 201310420276.0
• 申請日: 2013-09-16
• 公開（公告）號: CN103454412A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 程愛陽
• 申請（專利權）人: 南京博敏達生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林;劉艷艷

1.一種用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片包括：

A：過敏原探針：所述過敏原探針為一種單獨使用或多種選擇性地組合使用；每種過敏原探針為分別包被了一種過敏原提取物的熒光微球，不同種類的過敏原探針分別具有不同的熒光編碼；

B：生物素標記的抗IgE檢測抗體或生物素標記的抗IgG4檢測抗體，分別用來檢測結合到過敏原探針上的IgE抗體或IgG4抗體；當對人血清樣品進行檢測時，使用生物素標記的抗人IgE或抗人IgG4檢測抗體；當需要對動物的血清樣品進行檢測時，使用生物素標記的抗該種動物IgE的檢測抗體或抗該種動物相當于人IgG4的IgG亞類的檢測抗體；

C：報告分子：鏈親和素藻紅蛋白SA-PE或鏈親和素Cy3。

2.根據權利要求1所述的用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片用于對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量檢測時，還包括：D：總IgE探針：抗人IgE單克隆抗體包被的熒光微球，用于準備IgE標準曲線。

3.根據權利要求1或2所述的用于過敏原特異性抗體檢測的液相芯片，其特征在于，所述過敏原探針和/或總IgE探針的制備方法，包括以下步驟：

（1）1a：當制備過敏原探針時，準備過敏原溶液：將過敏原提取物凍干粉完全溶解于緩沖溶液中形成過敏原溶液，并測定其蛋白質含量；所述緩沖溶液為0.05M的MES緩沖液，其pH值為5.5-6.5；或者為0.01M磷酸鹽PBS緩沖液，其pH值為7.2-7.4；

1b：當制備總IgE探針時，準備抗體溶液：將抗人IgE抗體對0.01M磷酸鹽緩沖液反復透析，并測定其蛋白質含量；

（2）微球活化：

－取適量羧基化微球，離心并吸棄上清；將微球重新懸浮于超純水中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理，離心并吸棄上清；將微球懸浮于pH值為5.5-6.5，含0.05M-0.2M的2-（N-嗎啉代）乙磺酸緩沖溶液中，渦旋震蕩20-30秒，經超聲波分散處理后，離心并吸棄上清；

－將微球懸浮于上述MES緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，經超聲波分散處理后，分別加入過量新鮮配置的50mg/mL氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽即Sulfo-NHS和過量新鮮配置的使用的50mg/mL水溶性碳二亞胺即EDC溶液；在室溫下，避光孵育20-30min，每5分鐘將其溫和地顛倒混勻；孵育完成后離心并吸棄上清；

－將微球懸浮于上述MES緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，經超聲波分散處理后，離心并吸棄上清；重復該步驟；

（3）微球包被：將活化后的微球懸浮于對應的MES緩沖液或PBS緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理；

－向微球中加入設定量的過敏原溶液或者抗體溶液，室溫下避光孵育2-4h，其后離心移去上清；

－將包被后的微球懸浮于MES緩沖液或PBS緩沖液中，渦旋震蕩20-30秒，超聲波分散處理，離心并吸棄上清；重復該步驟；

（4）微球的封閉與保存：

－將包被好的微球懸浮并保存于含有牛血清白蛋白的貯存液中；

－每種包被與封閉好并可以在后續檢測中使用的微球稱為探針，探針通過血球計數板計數，使用時依據檢測需求比例混合。

4.一種對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量測量的方法，包括以下步驟：

1）以IgE標準品濃度為橫坐標，對應的微球熒光強度中位值MFI為縱坐標作圖，獲得五參數擬合曲線，即MFI=A+(D/(1+(X/C)^B)^E)，其中MFI為微球熒光強度中位值，A、B、C、D、E為方程式參數，可通過相關軟件計算得到；

2）將待測血清樣品的MFI值代入方程式，就可計算得到待測IgE的含量，即X值，所用公式為X=C{[D/(MFI-A)]^(1/E)-1}^(1/B)；

3）根據上述計算得到的IgE的含量-X值和血清樣品稀釋倍數，計算出樣品中過敏原特異性IgE抗體或總IgE抗體的濃度。

5.根據權利要求4所述的一種對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量測量的方法其特征在于：

－使用總IgE探針和IgE標準品獲得標準曲線，并使用該標準曲線計算過敏原特異性IgE抗體的含量；

－在檢測反應中，總IgE探針的使用數目和每種過敏原探針的使用數目相等或為已知比例。

6.根據權利要求5所述的一種對過敏原特異性IgE抗體進行半定量或定量測量的方法其特征在于：每種過敏原探針和總IgE探針的使用數目均在500個-5000個之間，并且每種過敏原探針和總IgE探針的使用數目相等。