[發明專利]一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1及其構建方法

有效

• 申請號: 201310419121.5
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN103525746A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 張文藝;陳雪珍;李仁霞
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/03;C12R1/07
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明屬于藍藻處理的微生物學領域，具體涉及一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌的構建方法。

背景技術

過量的N、P等物質進入水環境，水體接受的營養物質超過自身的凈化能力，導致藍藻等浮游植物過量繁殖，有浮力的浮游藍藻在水體表面的聚集，發生“水華”現象。此外，某些藍藻如銅綠微囊藻，其在繁殖過程中產生大量藻毒素儲存在細胞內，隨著藻細胞的死亡釋放出來，以溶解性的狀態存在于水中，嚴重威脅動物以及人類的健康。目前已被發現的藻毒素種類大約為80多種，其中毒性最大、含量最多的是MC-LR。

目前，國內外專家學者普遍認為生物法是解決藍藻水華問題最為有效、安全、經濟的方法，很多研究人員發現在暴發藍藻的天然水體、水庫、池塘、除藻裝置等不同環境中都存在著能夠溶解或感染藍藻細胞的微生物，它們主要歸屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等，并將統稱為溶藻細菌，但是溶藻細菌的研究尚處于實驗室階段，并未規模性的應用于實際工程中，而系統的研究溶藻細菌的溶藻特性，尋找細菌的最佳溶藻條件，探索細菌溶藻方式，可為藍藻水華生物防治工作提供一定的技術基礎，此外，細菌溶藻導致的藻毒素問題也逐漸被人們所重視。一系列具有藻毒素降解功能的藻毒素降解菌逐漸被人們分離出來用于處理藻毒素污染。

利用微生物溶藻，溶藻菌溶解藍藻細胞后，胞內的藻毒素會被釋放出來，這就需要藻毒素降解菌配合使用，但由于各種菌株的生活習性不同，對環境的要求不一致，構建一個既能溶藻又能解決其衍生的藻毒素污染問題的復合菌群，并使之適應環境，較為困難。利用原生質體融合技術將具有溶藻與藻毒素降解功能的親本菌株進行融合構建兼具雙親優良性狀的雙效工程菌，將同步解決溶藻及其衍生的藻毒素污染問題變為可能，目前，國內外學者對于以原生質體融合技術構建兼具溶藻與藻毒素降解功能的雙效工程菌的研究較少。

基于上述情況，本發明對溶藻細菌進行原生質體制備和再生、原生質體滅活并在此基礎上進行原生質體融合試驗，制備出既能溶藻又能降解MC-LR的雙效工程菌。

其中，T1為本課題組從太湖河浜底泥中分離篩得的MC-LR降解菌，為球形芽孢桿菌（Bacillus?sphaericus），16S?rDNA序列已提交至GenBank數據庫，獲得的16S?rDNA基因登陸號為HQ877618，該菌已送至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC?NO.4498。實驗方法與結果已申請專利，專利名稱為《微囊藻毒素降解菌株及利用其降解MC-LR的方法》，已獲得授權（批準號：2012061900548110），其原生質體制備與再生條件適宜參數已申請專利，專利名稱為《一種降解MC-LR的芽孢桿菌原生質體制備與再生的方法》（201210342202.5.）

F8為本課題組從太湖流域野生白鰱魚腸中篩選的溶藻細菌，為梭狀賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus?fusiformis），在美國國立生物技術信息中心（NCBI）GenBank中注冊序列號JQ991003，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號CGMCC?NO.6106。實驗方法與結果已申請專利，專利名稱為《溶藻細菌及其去除銅綠微囊藻的方法》（201210275810.9）。其原生質體制備與再生條件適宜參數已申請專利，專利名稱為《一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生方法》（201210342222.2）。

發明內容

本發明的目的在于解決藍藻水華及其衍生的藻毒素污染問題，鑒于溶藻菌溶解藍藻細胞后，胞內的藻毒素會被釋放出來，溶藻細菌與藻毒素降解菌配合使用時各種菌株的生活習性不同，對環境的要求不一致，構建一個既能溶藻又能解決其衍生的藻毒素污染問題的復合菌群，并使之適應環境，較為困難。因此，本發明的內容為利用原生質體融合技術將具有溶藻與藻毒素降解功能的親本菌株進行融合構建兼具雙親優良性狀的雙效工程菌，同步解決溶藻及其衍生的藻毒素污染問題。

本發明所采用的技術方案如下：

本發明提供了一種通過原生質體融合技術融合出的溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1，經鑒定其屬于球形芽孢桿菌（Bacillus?sphaericus），并于2013年4月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101），保藏編號為CGMCC?NO.7519。

本發明的目的是通過以下步驟來實現的。

本發明利用原生質體融合技術構建溶藻/藻毒素降解雙效工程菌的方法，依次包括以下步驟：

（1）親本菌體活化