[發明專利]一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1及其構建方法

有效

• 申請號: 201310419121.5
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN103525746A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 張文藝;陳雪珍;李仁霞
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/03;C12R1/07
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

1.一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1，?Bacillus?sphaericus，保藏編號為CGMCC?NO.7519。

2.權利要求1所述的一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1的構建方法，依次包括以下步驟：

親本菌體活化

將菌株T1、F8分別轉接至平板劃線分離2次，轉接至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30℃，轉速120?r/min的振蕩培養箱中分別培養24h、16h至對數期；

親本原生質體制備

T1菌株按照以下步驟進行：

a、菌體重懸：取4?ml活化的菌液，4500?r/min離心10?min，收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次；

b、酶解：用1.8ml的SMM緩沖液重懸，加入1?mg/mL的溶菌酶0.2ml和2?ml加熱至酶解溫度的EDTA溶液，使得體系酶濃度達到0.05?mg/mL，在水浴溫度30℃條件下酶解1?h；

c、原生質體重懸：3000?r/min離心收集原生質體，用0.55?mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4?ml?0.55?mol/L?NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質體；

F8菌株按照以下步驟進行：

a、菌體重懸：將4?mL活化的菌液4500?r/min離心10?min，以SMM緩沖液洗滌2-3次后用SMM緩沖液重懸；

b、酶解：加入溶菌酶使得體系濃度達到5mg/L，水浴溫度為33℃，保溫酶解時間為30min；

c、原生質體重懸：3000?r/min離心后以0.55?mol/L的NaCl溶液洗滌原生質體2-3次，再用4?mL?0.55?mol/L?NaCl溶液重懸原生質體；

親本原生質體滅活

將F8菌株的原生質體懸浮液放入水浴鍋中恒溫45℃保溫30min滅活，分別采用熱滅活與紫外滅活方式對T1菌株原生質體進行滅活；

其中，采用紫外滅活方式對T1菌株原生質體進行滅活，用紫外燈（12W）進行照射，與點光源距離15cm，照射60min；采用熱滅活方式對T1菌株原生質體進行滅活，滅活溫度分別為45、50、55、60℃，時間30min；

親本原生質體融合

將不同滅活方式處理后的兩親本原生質體各取1mL于5mL滅菌離心管中，混勻后3800rpm離心20min，棄去上清液，加入新生磷酸鈣溶液0.2mL并搖勻，加入1.8mL30%的PEG4000，酸堿度為8.0，30℃融合30min，后3800rpm離心10min，棄去上清液，用SMM溶液定容至2mL；

雙效工程菌融合子的傳代與篩選

將步驟（4）中的雙效工程菌菌懸液梯度稀釋后選取合適濃度涂布于高滲培養基，30℃恒溫培養48h，觀察細菌形態、大小，挑取不同形態大小的菌落重新轉接至平板，劃線分離4次，30℃恒溫培養48h，觀察菌落形態，以游標卡尺測量菌落直徑并求平均值；

對挑選出的大于親本直徑的菌株進行溶藻實驗和藻毒素降解實驗，F8和T1菌株為對照組；

溶藻實驗以1：10的菌藻比，12h：12h光照條件進行。

3.根據權利要求1所述的一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1的構建方法，其特征在于其中步驟（1）中所述的細菌培養基組成如下：牛肉膏3?g；蛋白胨10?g；NaCl?5?g；蒸餾水1000?mL；pH?7.0-7.2；若為固體培養基則添加瓊脂粉2.4%；上述培養基根據要求在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌20?min。

4.根據權利要求1所述的一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1的構建方法，其特征在于其中步驟（5）中所述的高滲液體培養基組成如下：蛋白胨?10?g，酵母浸出汁?5?g，牛肉膏?5?g，蔗糖?170?g（0.5?mol/L），蒸餾水定容至1000?mL，pH?7.2；若為高滲固體培養基則加入瓊脂粉20-24?g；上述培養基根據要求在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌20?min。