[發明專利]一種雞常見食源性細菌四重熒光PCR檢測試劑盒及使用方法

有效

• 申請號: 201310417980.0
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN103436626A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 張騰飛;王紅琳;羅玲;張蓉蓉;羅青平;溫國元;邵華斌
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/145;C12R1/42;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種雞常見食源性細菌四重熒光PCR檢測試劑盒，還涉及一種雞常見食源性細菌四重熒光PCR檢測試劑盒的使用方法。

背景技術

產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和空腸彎曲桿菌是雞攜帶的4種最常見的食源性致病細菌，它們不僅嚴重危害我國養禽業，而且通過食品污染感染人類，給人類健康造成威脅。

產氣莢膜梭菌為人畜共患病病原，也是食源性病原菌。雞群為產氣莢膜梭菌的主要宿主之一，產氣莢膜梭菌在雞體內為條件性致病菌，可引起雞壞死性腸炎，也有很多帶菌不發病的情況。人類誤食該菌污染的雞肉制品等，可引起食物中毒。產氣莢膜梭菌是引起人食物中毒和氣腫疽的主要病原體。

沙門氏菌是一種常見的人畜共患病病原，該菌不僅能引起雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒等禽類疾病，危害養禽業，還能夠感染人類，引起胃腸炎、傷寒、敗血癥及腸外灶性感染等多種疾病。據統計，沙門氏菌引起的食物中毒常列世界各國細菌性食物中毒榜首，我國內陸地區也以沙門氏菌為首位。其中沙門氏菌感染禽是經食物鏈傳染給人類的一個重要中介。

大腸桿菌O157:H7感染是一種食源性疾病，該菌可從雞肉、牛肉、奶牛或奶制品、蔬菜、飲料及水中分離到，其中雞群也是該菌的宿主之一。該菌為一種腸道出血性大腸桿菌，是食物中毒的原因之一。感染者通常發生出血性腹瀉，尤其在年輕兒童和年長者中，有時導致腎衰竭。世界各地多次爆發大腸桿菌O157:H7感染，嚴重危害了公共衛生安全。

空腸彎曲菌是一種食源性人畜共患病病原菌，其中家禽特別是雞群為空腸彎曲桿菌的主要宿主之一，通常成年雞感染空腸彎曲桿菌無明顯癥狀，然而食入空腸彎曲桿菌污染的雞肉制品等，極易引起人類感染，導致急性腸胃炎，隨后還可以引起自身免疫性并發癥，如格巴氏綜合征和關節炎。空腸彎曲菌也是引起全世界人類細菌性腹瀉的主要原因之一。

雞群是以上4種細菌的主要宿主之一，然而這些細菌通常被雞攜帶卻未表現出對雞的致病性，或無明顯的病變，容易被被養殖者忽視，但是這些病原菌一旦污染雞肉等食品，則會引起食品安全問題。世界各國已對食品安全高度重視，對雞肉制品等食品中微生物攜帶提出了明確的要求，從養殖開始控制與清除這些食源性細菌是避免食品污染的關鍵。因此迫切需要一種可同時快速、準確地檢測雞群或雞肉制品中多種食源性致病菌的檢測方法。目前實驗室的診斷方法主要是依靠細菌的分離鑒定，但是該方法檢測時間長、操作繁瑣，也難以大批量進行。目前也有針對單個病原建立的PCR等檢測方法，但是尚未有能系統檢測雞或雞肉制品中多種食源性致病菌的方法與標準。實時熒光PCR快速、高效、敏感性好、特異性強，而且可以同時進行多種病原菌的檢測，已成為病原菌檢測的一種重要的方法。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種雞常見食源性細菌四重熒光PCR檢測試劑盒，該試劑盒由熒光PCR反應液、陽性對照（產氣莢膜梭菌標準品、沙門氏菌標準品、大腸桿菌O157:H7標準品和空腸彎曲桿菌標準品）以及陰性對照品組成。以往在家禽中檢測病原菌多通過細菌的分離鑒定或運用針對單個菌的PCR檢測，本檢測試劑盒針對雞源最常見的4種食源性細菌，設計并篩選出互不干擾的4對檢測引物與4條探針，4種雞主要食源性細菌檢測在一個反應中完成，更為高效，且敏感性好，特異性強，檢測下限達到10cfu。

本發明還有一個目的是在于提供了一種雞常見食源性細菌四重熒光PCR檢測試劑盒的使用方法，方法簡單，快速，所有檢測步驟可在2個小時內完成。

為了實現上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種雞常見食源性細菌四重熒光PCR檢測試劑盒，含有以下成分：

熒光PCR反應液：Taq?DNA聚合酶、不含Mg²⁺的PCR反應緩沖液、Mg²⁺、dNTPs、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和空腸彎曲桿菌這4種細菌的特異性引物和相應的4種熒光探針。試劑盒中包含4對引物和4條探針序列如下：

表1特異性引物序列表

表2特異性探針序列表

陽性對照：為產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和空腸彎曲桿菌標準品，或產氣莢膜梭菌標準品為產氣莢膜梭菌cpa基因陽性質粒、沙門氏菌標準品為沙門氏菌invA基因陽性質粒、大腸桿菌O157:H7標準品為大腸桿菌O157:H7rfbB基因陽性質粒和空腸彎曲桿菌標準品為空腸彎曲噶桿菌ccoN基因陽性質粒。

陰性對照：為滅菌的無酶雙蒸水。