[發(fā)明專(zhuān)利]一種雞常見(jiàn)食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒及使用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310417980.0
• 申請(qǐng)日: 2013-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103436626A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張騰飛;王紅琳;羅玲;張蓉蓉;羅青平;溫國(guó)元;邵華斌
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/145;C12R1/42;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種雞常見(jiàn)食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括：熒光PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照，四對(duì)細(xì)菌的特異性引物：CP01、CP02、SE01、SE02、EC01、EC02、CJ01、CJ02和四種熒光探針：CPP、SEP、ECP、CJP；

所述的熒光PCR反應(yīng)液為：rTaq?DNA聚合酶、不含Mg²⁺的10×PCR反應(yīng)緩沖液、25mM?Mg²⁺和10mM?dNTPs；

所述的陽(yáng)性對(duì)照為：產(chǎn)氣莢膜梭菌；沙門(mén)氏菌；大腸桿菌O157:H7和空腸彎曲桿菌的標(biāo)準(zhǔn)品或產(chǎn)氣莢膜梭菌cpa基因陽(yáng)性質(zhì)粒；沙門(mén)氏菌invA基因陽(yáng)性質(zhì)粒；大腸桿菌O157:H7?rfbB基因陽(yáng)性質(zhì)粒和空腸彎曲噶桿菌ccoN基因陽(yáng)性質(zhì)粒；

所述的特異性引物為：

CP01：?5’?TGTAAGGCGCTTATTTGTGCT?3’

CP02：?5’?CCCTTGAGTTACAATCATAGCATG?3’

SE01：?5’?GCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGC?3’

SE02：?5’?CCAGTACGATATTCAGTGCGATC?3’

EC01：?5’?TTCATGATGCTGTGGAAAACA?3’

EC02：?5’?TGCTTGCAGAAGCCATATCA?3’

CJ01：?5’?TACAGATTGGATTCCAGGACA?3’

CJ02：?5’?CTATACCTGTGGTTTGGATCCA?3’

所述的特異性探針為：

CPP?：5’?FAM-ACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGG-BHQ1??3’

SEP?：5’?TAMRA-TCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTAC-BHQ2??3’

ECP?：5’?ROX-TTCTCCGAATGTTGTTGTTTGGGGAAG-BHQ2??3’

CJP?：5’?HEX-TTCATGATGGAACATTAGGTTGGGTAGGAT-BHQ2??3’。

2.權(quán)利要求1所述試劑盒的使用方法，具體如下：

1）樣品的處理與DNA模板的提取：

使用試劑盒提取DNA模板，取5μl作為待測(cè)樣品，每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；

2）反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)：

反應(yīng)體系如下：?

10×PCR buffer5μlMg²⁺1.5mM2.5 mM dNTPs4μl10mM引物?CP01、CP02各1μlSE01、SE02各1μlEC01、EC02各1μlCJ01、CJ02各1μl10mM探針?CPP、SEP、ECP、CJP各1μlrTaq 0.5μl模板5μl去離子H₂O補(bǔ)至50μl總體積50μl

熒光PCR反應(yīng)在多通道熒光定量PCR儀上進(jìn)行，選擇熒光信號(hào)FAM、TAMRA、ROX和HEX，反應(yīng)參數(shù)為：95°C?10?min，然后95°C?10?sec，60°C?45?sec，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，其中在60°C?進(jìn)行四重?zé)晒鈾z測(cè)，閾值設(shè)置為閾值線(xiàn)剛好超過(guò)正常陰性樣品的最高點(diǎn)；

3）結(jié)果的判斷：

質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn):

陰性對(duì)照：無(wú)Ct值，無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)；

陽(yáng)性對(duì)照：Ct值≤30，擴(kuò)增曲線(xiàn)明顯呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)；

如果陰性對(duì)照或者陽(yáng)性對(duì)照有一項(xiàng)不符合標(biāo)準(zhǔn)則本次檢測(cè)無(wú)效；

判定結(jié)果：

4種探針均無(wú)Ct值、無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)的樣本為檢測(cè)結(jié)果陰性；1種或者幾種探針Ct值≤35的樣本，檢測(cè)結(jié)果則為各自探針對(duì)應(yīng)細(xì)菌的陽(yáng)性，表示檢測(cè)樣本含有陽(yáng)性結(jié)果探針對(duì)應(yīng)的靶細(xì)菌；Ct值在35~40之間為灰值區(qū)域，重做后Ct值＜37且有擴(kuò)增曲線(xiàn)的為陽(yáng)性，其余判斷為陰性。