[發(fā)明專利]一種PCR法檢測(cè)人ERCC1基因表達(dá)水平的試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310416741.3
• 申請(qǐng)日: 2013-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN103451303A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 凌曉光;狄峰;蔣雅麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇康克生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 楊海軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用PCR法檢測(cè)人ERCC1基因表達(dá)水平的試劑盒。

背景技術(shù)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(non-small?cell?lung?cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的75%～80%，多數(shù)病例在確診時(shí)已屬晚期，雖然鉑類新藥化療是目前治療晚期NSCLC的基本方案，但有效率亦僅為25%～30%，且腫瘤病人存在不同程度的異質(zhì)性、對(duì)化療的藥物敏感性也不盡相同，故依據(jù)耐藥基因及藥敏選擇藥物化療成為了國(guó)際趨勢(shì)[4]。鉑類抗癌藥物與癌細(xì)胞DNA分子作用，形成藥物-DNA分子配合物，破壞DNA，從而抑制癌細(xì)胞分裂。已有研究顯示，核苷酸切除修復(fù)途徑（NER）因具修復(fù)DNA的作用而與鉑類耐藥關(guān)系密切，其中關(guān)于ERCC1的研究較多，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ERCC1表達(dá)水平的高低與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病及預(yù)后都有緊密的關(guān)系。

ERCC1（excision?repair?cross?complementation1，切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1）是核苷酸外切修復(fù)家族中的重要成員，ERCC1是重要的核苷酸外切修復(fù)酶之一，位于19號(hào)染色體上，編碼297個(gè)氨基酸的蛋白，與XPF形成異源二聚體，在DNA單鏈?zhǔn)軗p處的5′端進(jìn)行剪切而發(fā)揮功能。ERCC1的過(guò)表達(dá)可使停滯在G2/M期的損傷DNA迅速修復(fù)，導(dǎo)致其對(duì)順鉑耐藥，ERCC1表達(dá)量直接影響DNA的修復(fù)，因此ERCC1可作為腫瘤細(xì)胞中藥物-DNA結(jié)合物修復(fù)能力的檢測(cè)標(biāo)志。

Booton[32]等研究了低ERCC1水平與用鉑類加吉西他濱治療的非小細(xì)胞肺癌病人生存期之間的關(guān)系，結(jié)果表明相比高水平(20.4weeks,95%confidence?interval,6.9–33.9weeks)來(lái)說(shuō)，低表達(dá)腫瘤患者的中位存活期明顯更長(zhǎng)(61.6weeks；95%confidence?interval，42.4–80.7weeks)。數(shù)據(jù)顯示，ERCC1表達(dá)水平可以作為用CDDP（順氨氯鉑）治療晚期NSCLC存活期的預(yù)測(cè)因子。Vilmar[33]等研究了443例NSCLC晚期病人，結(jié)果顯示ERCC1陰性和ERCC1陽(yáng)性的Median?overall?survival(OS)分別是11.8和9.8months，ERCC1蛋白表達(dá)為陰性的存活期比陽(yáng)性表達(dá)者要長(zhǎng)。Leng[34]和Roth[4]以及Pesta[35]的研究結(jié)果也與上述結(jié)果一致，表明ERCC1的mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)可以用來(lái)預(yù)測(cè)NSCLC病人鉑類藥物的預(yù)后。研究者們除了對(duì)ERCC1和鉑類藥物療效關(guān)系進(jìn)行了研究[40]，也研究了該結(jié)果在個(gè)體化治療中的效果[41]。Cobo[43]也根據(jù)ERCC1mRNA的表達(dá)給予多西他賽加順鉑(低表達(dá)組)或多西他賽加吉西他濱(高表達(dá)組)化療，對(duì)照組均給予多西他賽加順鉑化療。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組（即低表達(dá)組和高表達(dá)組）客觀緩解率(ORR)、無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)均高于對(duì)照組，表明ERCC1的表達(dá)可以預(yù)測(cè)化療療效。

現(xiàn)有的采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ERCC1基因蛋白表達(dá)水平用于臨床指導(dǎo)鉑類藥物的應(yīng)用，由于免疫組織化學(xué)方法自身的缺陷，諸如：實(shí)驗(yàn)過(guò)程所受干擾因素多，結(jié)果判讀受主觀因素影響大等，以及蛋白水平不能準(zhǔn)確反映基因?qū)嶋H表達(dá)水平，因此，新的能夠準(zhǔn)備檢測(cè)ERCC1基因mRNA水平的方法是十分必需的。

目前關(guān)于檢測(cè)ERCC1表達(dá)的試劑盒的研究也在不斷進(jìn)行中，劉輝等曾報(bào)道過(guò)一種熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ERCC1mRNA表達(dá)量的試劑盒的專利（申請(qǐng)?zhí)枺?01110032311.2），選用了β-actin作為參比基因，得到的表達(dá)量以SPSS統(tǒng)計(jì)分析高表達(dá)和低表達(dá)，并以免疫組化作為金標(biāo)準(zhǔn)與之比較，結(jié)果顯示采用熒光定量PCR檢測(cè)ERCC1mRNA水平，檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高，但是該專利對(duì)于PCR結(jié)果并未進(jìn)行深入的截?cái)嘀?cutoff值)分析等，降低了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。邵琦等也曾發(fā)表ERCC1基因表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的專利（申請(qǐng)?zhí)枺?01210333113.4），但是該專利中并未運(yùn)用外部校準(zhǔn)品法檢測(cè)ERCC1基因表達(dá)。

上述研究報(bào)道說(shuō)明ERCC1的表達(dá)與肺癌預(yù)后及鉑類化療耐藥有關(guān)，在早期術(shù)后患者中ERCC1高表達(dá)者生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，預(yù)后好。而在接受鉑類化療的晚期NSCLC患者中，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)者反而較陰性者預(yù)后差，ERCC1陰性者無(wú)病生存期及總的生存期較陽(yáng)性者明顯延長(zhǎng)，可作為指導(dǎo)預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。但目前關(guān)于檢測(cè)ERCC1基因表達(dá)的試劑盒均沒(méi)有采用RNA校準(zhǔn)品，不能在不同次或不同實(shí)驗(yàn)室中減少實(shí)驗(yàn)誤差，無(wú)法獲得各實(shí)驗(yàn)間的相互比較。

發(fā)明內(nèi)容