[發明專利]胰島素修飾物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201310416494.7
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103467594A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 汪士奇;何巧;秋云海
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/107;C07K1/02;A61K38/28;A61P3/10
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，特別是涉及一種胰島素修飾物及其制備方法和應用。

背景技術

1999年的一項統計（數據來自Veterinary?Medical?Database?VMDB）表明犬貓糖尿病發病率在1970到1998這28年間從0.2％上升到1％，且上升趨勢越見明顯。幾乎100％的犬和50％的貓，都是I型(胰島素依賴性)糖尿病。患貓的另50％是Ⅱ型(非胰島素依賴性)糖尿病。在眾多治療糖尿病的方法中，胰島素注射是最主要和最直接的方法。自1922年成功應用于臨床之后，胰島素歷經了80年的發展。最初的第一代胰島素是從動物（豬/牛）體內提取，到1942年第二代胰島素是通過大腸桿菌等系統生物合成人序列的胰島素，而現在的第三代重組胰島素類似物，通過對胰島素序列進行氨基酸替換，或特定位點進行化學修飾而賦予了藥物特殊的優化功能。它治療了眾多糖尿病患者，同時也為醫藥行業帶來了極為豐厚的經濟效益。

胰島素衍生物因其能通過各種化學修飾實現緩控釋等功能，一直被研究較多，但是胰島素衍生物用于動物糖尿病的治療一直未見報道。

目前應用于寵物糖尿病常用的胰島素藥物除人用胰島素制劑（NPH低精蛋白鋅混懸液,PZI魚精蛋白胰島素,Lente鋅胰島素混懸液,Glargine甘精胰島素類似物等）外，主要有兩種專為動物設計的胰島素制劑。一種是美國默克醫藥集團的豬鋅胰島素混懸液（商品名為Vetsulin），該胰島素制劑為35%無定型性和65%結晶性豬胰島素組成的混懸液。另一種是德國勃林格翰醫藥公司的魚精蛋白重組人胰島素懸浮液（商品名為Prozinc）。這兩種動物專用胰島素藥物均已獲FDA美國藥監局獲批上市。

這兩種胰島素藥物的主要局限性在于，它們的緩釋效果非常有限。Vetsulin通過控制胰島素晶型配比實現一定程度的緩釋，因為胰島素結晶態比無定型態溶解速度慢，因此藥物在進入體內之后能實現兩次釋放過程，從而延長藥效；Prozinc通過加入魚精蛋白實現緩釋，因為魚精蛋白是堿性蛋白，能保持胰島素進入體內后的電中性，延緩其作用過程。但是上述兩種緩釋機制的效果有限，其起效時間在14-24小時之間，作為寵物用產品便利性不夠。另外Vetsulin結晶狀態的不穩定，Prozinc魚精蛋白的免疫原性都可能影響藥物的安全使用。

因此，目前尚未有一種用于動物糖尿病的治療的具有良好的緩釋效果和較高安全性能的胰島素修飾物。

發明內容

基于此，有必要提供一種用于動物糖尿病的治療的具有良好的緩釋效果和較高安全性能的胰島素修飾物，及其制備方法和應用。

一種胰島素修飾物，包括胰島素以及連接在所述胰島素B鏈末端的脂肪酸鏈；

所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素，所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸被切除，所述脂肪酸鏈與所述胰島素B鏈第29位的賴氨酸如下通式表示：

Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH₂)_m-COOH，其中，Lys為胰島素B鏈第29位的賴氨酸，Glu為連接在所述脂肪酸鏈末端的谷氨酸，Lys與Glu之間以酰胺鍵連接，Glu通過酰胺鍵連接在所述脂肪酸鏈末端，m為6～32的整數。

一種胰島素修飾物的制備方法，包括如下步驟：

提供胰島素，并使用羧基肽酶A將所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸切除，得到修飾過的胰島素，所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素；

將結構式為(CH₂)_m(COOH)₂的化合物A溶解在甲醇中，在堿存在的條件下進行皂化反應，接著將產物溶于HCl酸化的庚烷中，重結晶后得到結構式為CH₃OOC(CH₂)_mCOOH的化合物B，其中，m為6～32的整數；

將所述化合物B和足量的具有如下結構式的化合物C溶解在THF中，在催化劑存在的條件下，攪拌20h后真空蒸發除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯中并依次用鹽酸和水洗滌，接著用硫酸鎂干燥，過濾后保留液相并真空干燥，得到固體殘余為具有如下結構式的化合物D，

將所述化合物D與足量的谷氨酸-1-甲酯溶解在二甲基甲酰胺中，在所述催化劑存在的條件下，攪拌20h后真空蒸發，殘留物溶于乙酸乙酯中并依次用鹽酸和水洗滌，接著用硫酸鎂干燥，過濾后保留液相并真空干燥，得到的固體殘余為具有如下結構式的化合物E，

谷氨酸-1-甲酯