[發明專利]胰島素修飾物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201310416494.7
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103467594A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 汪士奇;何巧;秋云海
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/107;C07K1/02;A61K38/28;A61P3/10
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

1.一種胰島素修飾物，其特征在于，包括胰島素以及連接在所述胰島素B鏈末端的脂肪酸鏈；

所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素，所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸被切除，所述脂肪酸鏈與所述胰島素B鏈第29位的賴氨酸如下通式表示：

Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH₂)_m-COOH，其中，Lys為胰島素B鏈第29位的賴氨酸，Glu為連接在所述脂肪酸鏈末端的谷氨酸，Lys與Glu之間以酰胺鍵連接，Glu通過酰胺鍵連接在所述脂肪酸鏈末端，m為6～32的整數。

2.一種胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

提供胰島素，并使用羧基肽酶A將所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸切除，得到修飾過的胰島素，所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素；

將結構式為(CH₂)_m(COOH)₂的化合物A溶解在甲醇中，在堿存在的條件下進行皂化反應，接著將產物溶于HCl酸化的庚烷中，重結晶后得到結構式為CH₃OOC(CH₂)_mCOOH的化合物B，其中，m為6～32的整數；

將所述化合物B和足量的具有如下結構式的化合物C溶解在THF中，在催化劑存在的條件下，攪拌20h后真空蒸發除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯中并依次用鹽酸和水洗滌，接著用硫酸鎂干燥，過濾后保留液相并真空干燥，得到固體殘余為具有如下結構式的化合物D，

將所述化合物D與足量的谷氨酸-1-甲酯溶解在二甲基甲酰胺中，在所述催化劑存在的條件下，攪拌20h后真空蒸發，殘留物溶于乙酸乙酯中并依次用鹽酸和水洗滌，接著用硫酸鎂干燥，過濾后保留液相并真空干燥，得到的固體殘余為具有如下結構式的化合物E，

谷氨酸-1-甲酯

將所述化合物E、足量的具有如下結構式的化合物F和足量的具有如下結構式的化合物G溶解在二氯甲烷中，冰浴冷卻條件下攪拌20h，過濾保留液相并真空干燥，得到具有如下結構式的化合物H，

將所述修飾過的胰島素溶于碳酸鈉的水溶液中得到第一溶液，同時將所述化合物H溶于乙腈中得到第二溶液，將所述第一溶液和所述第二溶液混合，30min后用乙醇胺終止反應，向反應體系中加水并調節pH為5.5產生沉淀，保留沉淀并將該沉淀重新溶解后與等體積的0.2mol/L的NaOH溶液混勻進行皂化反應，反應完成后調節pH為5.5，保留沉淀，分離純化后得到所述胰島素修飾物，所述胰島素修飾物包括所述胰島素以及連接在所述胰島素B鏈末端的脂肪酸鏈，所述脂肪酸鏈與所述胰島素B鏈第29位的賴氨酸如下通式表示：Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH₂)_m-COOH，其中，Lys為胰島素B鏈第29位的賴氨酸，Glu為連接在所述脂肪酸鏈末端的谷氨酸，Lys與Glu之間以酰胺鍵連接，Glu通過酰胺鍵連接在所述脂肪酸鏈末端。

3.根據權利要求2所述的胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，使用羧基肽酶A將所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸切除，得到修飾過的胰島素的操作為：

將胰島素鋅鹽溶解在水中并用質量濃度為33%的NaOH調節pH為9.3，接著按照所述胰島素鋅鹽與EDTA的質量比為100：1加入EDTA，混勻后在室溫、攪拌的條件下，按照羧基肽酶A和所述胰島素鋅鹽質量比為0.5:100，加入所述羧基肽酶A的懸浮液，15h后加水稀釋并用濃醋酸調節pH為3.6，接著加入甲醇和醋酸鋅的水溶液，最后用濃氨水調節pH為6.0，過濾后保留沉淀，即為所述修飾過的胰島素。

4.根據權利要求2所述的胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，所述得到固體殘余為具有如下結構式的化合物D的操作中，所述化合物B和所述化合物C的摩爾比為0.91：1.1，所述催化劑為N,N-二異丙基乙胺，所述催化劑與所述化合物C的摩爾比為1：1；

所述化合物D與所述谷氨酸-1-甲酯的摩爾比為1：1，所述催化劑與所述化合物D的摩爾比為1：1。

5.根據權利要求2所述的胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，所述得到具有如下結構式的化合物H的操作中，所述化合物E、所述化合物F和所述化合物G的摩爾比為1：1：1。