[發(fā)明專利]一種雙脫氧核苷修飾的引物方法、反應(yīng)體系及其在突變檢測中的應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310415707.4 | 申請日： | 2013-09-12 |
| 公開（公告）號： | CN104450869B | 公開（公告）日： | 2020-07-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張馳宇;樊路娟;藍(lán)柯 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6858 | 分類號： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100 | 代理人： | 陳靜 |
| 地址： | 200025 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 脫氧 核苷 修飾 引物 方法 反應(yīng) 體系 及其 突變 檢測 中的 應(yīng)用 | ||
1.一種檢測待測基因的待測突變位點上是否存在突變的方法，所述的檢測是非疾病診斷性的檢測，其特征在于，所述方法包括：
(1)以待測基因為模板，以正向引物和反向引物為引物，以高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶混合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的高保真DNA聚合酶與非高保真DNA聚合酶的比例是(0.05-0.3):1；
所述的正向或反向引物中任一條為辨別性引物，以其3’末端堿基起算第1-8位的任意1個或多個堿基對應(yīng)待測突變位點，但與野生型序列相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；且，所述的辨別性引物的3’末端核苷戊糖3號C的羥基進(jìn)行雙脫氧修飾；
所述的正向或反向引物中辨別性引物以外的另一引物位于基因突變位點下游或上游且與相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；
(2)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明待測基因的待測突變位點存在突變；若未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明待測基因的待測突變位點不存在突變。
2.一種檢測基因突變的方法，所述的檢測是非疾病診斷性的檢測，其特征在于，所述方法包括：
(1)’以待測基因為模板，以正向引物和反向引物為引物，以高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶混合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的高保真DNA聚合酶與非高保真DNA聚合酶的比例是(0.05-0.3):1；
其中，所述的正向或反向引物中任一條為辨別性引物，以其3’末端堿基起算第1-8位的任意1個或多個堿基對應(yīng)待測突變位點，但與突變型序列相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；且，所述的辨別性引物的3’末端核苷戊糖3號C的羥基進(jìn)行雙脫氧修飾；
所述的正向或反向引物中辨別性引物以外的另一引物位于基因突變位點下游或上游且與相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；
(2)’分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明待測基因的待測突變位點不存在突變；若未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明待測基因的待測突變位點存在突變。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的突變包括：點突變、插入突變、缺失突變。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；所述的非高保真DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶包括：Pfu DNA聚合酶、HS DNA聚合酶、Q5TM超保真DNA聚合酶等。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的非高保真DNA聚合酶包括：Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶與非高保真DNA聚合酶的比例是(0.1-0.2):1。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶與非高保真DNA聚合酶的比例是(0.14-0.19):1。
9.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(2)或(2’)中，通過電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；或通過熒光定量方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
10.一種用于檢測待測基因的待測突變位點上是否存在突變的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括：
正向引物和反向引物，其一作為辨別性引物，以其3’末端堿基起算第1-8位的任意1個或多個堿基對應(yīng)待測突變位點，但與野生型或突變型序列相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；且，所述的辨別性引物的3’末端核苷戊糖3號C的羥基進(jìn)行雙脫氧修飾；
正向引物和反向引物中另一引物位于基因突變位點下游或上游且與相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；該引物為正常引物，不經(jīng)任何修飾；以及
高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶，且所述的高保真DNA聚合酶與非高保真DNA聚合酶的比例是(0.05-0.3):1。
11.權(quán)利要求10的檢測試劑盒的用途，用于檢測待測基因的待測突變位點上是否存在突變，所述的檢測是非疾病診斷性的檢測。
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