[發明專利]一種雙脫氧核苷修飾的引物方法、反應體系及其在突變檢測中的應用

有效

• 申請號: 201310415707.4
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN104450869B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 張馳宇;樊路娟;藍柯
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及一種雙脫氧核苷修飾的引物方法、反應體系及其在突變檢測中的應用。本發明人結合3’末端封閉的引物和高保真DNA聚合酶的3’?5’外切酶校正功能，優化了一種操作簡單快捷、靈敏性強、準確度高的檢測方法，可廣泛用于與點突變、單核苷酸多態性、插入和缺失突變檢測相關的領域。

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，更具體地說，涉及一種雙脫氧核苷修飾的引物方法及基于該引物和高保真DNA聚合酶、非高保真DNA聚合酶的核酸擴增方法及用于點突變、缺失、插入突變檢測試劑盒及其應用。

背景技術

點突變也稱作單堿基替換，指由單個堿基改變發生的突變，可以分為轉換和顛換兩類。轉換是指嘌呤和嘌呤之間的替換或嘧啶和嘧啶之間的替換；顛換是指嘌呤和嘧啶之間的替換。DNA分子中單堿基突變廣泛存在于生物體遺傳信息的編碼中，是導致遺傳性疾病的重要原因之一。就人類基因組而言，在眾多導致人類疾病的基因有義突變、病原體亞型以及耐藥基因的有義突變中，單堿基突變占了相當大的比例，其檢測方法的探索一直是基因診斷研究中的重要課題，特別是對已知有義突變的檢測，將是臨床進行基因診斷的重要手段之一。

單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，主要是指在染色體基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，而其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。這種多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換或顛換所引起，也可由堿基的插入或缺失所致，但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。SNP的檢測分析，可應用于醫學上疾病易感性研究，解釋個體間的表型差異對疾病的易感程度；可應用于藥物基因組學及臨床耐藥研究，分析不同基因型個體對藥物反應的差異，指導藥物開發及臨床合理用藥；可應用于種族遺傳學和連鎖不平衡性分析；還在基因組制圖以及遺傳育種等方面有重大意義。

實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)是定量PCR的一種，指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。Real-Time PCR的檢測方法包括：熒光染料嵌合法和熒光探針法。SYBR GreenI是一種常用的熒光染料，能結合于所 有dsDNA雙螺旋的小溝區域。SYBR Green I與dsDNA結合熒光信號可增強800-1000倍。在PCR反應體系中加入過量SYBR Green I熒光染料，SYBRGreen I熒光染料摻入DNA雙鏈后，熒光信號增強，而不摻入鏈中的SYBR Green I染料分子熒光不變，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

點突變、缺失和插入突變所造成的基因理化特性改變甚微，無疑使與之相關的檢測非常困難，目前對單核苷酸突變位點的檢測技術主要包括：單鏈構象多態性(Single-Strand Conformational Polymorphism，SSCP)技術、異源雙鏈分析(hereroduplexanalysis，HA)技術、變性高效液相色譜法(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)、變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)、化學錯配裂解法(chemical mismatch cleavage，CMC)、焦磷酸序列(Pyrosequencing)分析技術、質譜法(mass spectrometry)、DNA芯片(DNA chip)技術、限制性片段長度多態性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、等位基因特異性PCR(allele specific PCR，ASPCR)、分子信標(molecular beacons)技術等。這些傳統的檢測方法大多操作復雜、費時繁瑣且特異性、靈敏性及準確性較差。

因此，本領域仍然需要開發優化的、結果穩定、重復性好的基因突變檢測方法，以應用于快速進行基因突變檢測。

發明內容