[發明專利]一種利用混合模式層析介質連續分離純化抗體的方法

有效

• 申請號: 201310415434.3
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103505908A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 史清洪;柴東升;孫彥;白姝
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: B01D15/18
• 分類號: B01D15/18;C07K1/22
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 張建綱

技術領域

本發明涉及一種利用混合模式層析介質連續吸附技術純化抗體的方法，具體是一種通過多層析柱串聯連續吸附裝置分離純化抗體的方法，屬于抗體純化技術領域。

背景技術

抗體是一類特殊的蛋白質分子，被廣泛地用于腫瘤等疾病的診斷與治療中并隨著不斷的發展，形成了包括多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體在內的三代抗體。截至2012年底，世界各國已經批準了超過30種用于治療癌癥、感染及免疫缺陷疾病的單抗和基因工程抗體藥物；2011年，抗體藥物已占據了當年全球藥物銷售額十強中的四席，銷售額超過250億美元。

抗體產品主要來源于捐獻者及各類動物的血漿成分或者動物細胞培養上清液等生物原料中。目前，抗體純化方法大致分為沉淀法和層析法。沉淀分離技術是早期抗體制品制備的主要手段，作為其主要代表的Cohn低溫乙醇沉淀技術當前仍是從血漿等體液中提取抗體的主要工藝。沉淀法雖具有工藝簡單、安全性高的優點，但生產條件苛刻、產品的收率和純度較低、自動化水平低也是沉淀法的固有頑疾。此外，沉淀試劑引發的回收、排放和污染問題也是抗體制備中最值得關注的。與之相比，層析法因具備工藝條件溫和、通量大、自動化程度高、易于清潔消毒、滿足GMP等現行優勢，被廣泛應用于抗體的分離純化。當前用于抗體純化的主要有凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析及蛋白A親和層析，其中蛋白A親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析聯用純化抗體已經成為了單抗制備的“黃金標準”工藝。但是作為上述工藝核心技術的蛋白A親和層析技術也存在著層析介質成本高昂、洗脫和再生條件嚴苛、蛋白A配基的酸堿穩定性差且易脫落等缺陷，同時蛋白A層析介質的抗體載量通常不足30mg/g介質并隨著蛋白A配基的脫落或酶解而惡化，導致規模化生產過程中介質需求量巨大，推高生產成本。

上述缺陷使得蛋白A層析介質在實際應用中受到限制，由此一些可替代蛋白A層析介質的、以色素衍生物、雜環化合物等小分子化合物為配基的新型層析介質應運而生。美國頗爾（Pall）公司的MEPHyperCel介質就是其中的代表。MEP?HyperCel介質是一種在抗體分離中得以采用的、以4-硫醇基-乙基-吡啶（4-Mercapto-Ethyl-Pyridine，MEP）為配基的商品化混合模式層析（mixed-mode?chromatography，MMC）介質。所述MEP配基的pKa為4.8；當pH大于4.8時（通常為6～9的范圍內），配基通過疏水相互作用與抗體結合；當pH小于4.8時（通常為4.0左右），配基和抗體都帶有正電荷，抗體因與MEP配基間的靜電排斥而洗脫，從而實現抗體的分離純化。美國專利US6,498,236B1（UpFront?Chromatography?A/S公司）公開了另一種固相材料表面偶聯含羧基的芳香族化合物的層析介質用于抗體的分離。中國專利CN101185881A公開了一種用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質及其制備方法。所述色譜介質為間隔臂末端偶聯含有咪唑基團和苯環的雙環化合物分子作為色譜介質配基；制備得到的層析介質對抗體具有選擇性，可以實現從血漿、腹水、細胞培養上清液中直接分離純化抗體。Bak和Thomas將包括MEP?HyperCel在內的多種MMC層析介質在抗體分離純化中的性能與蛋白A層析介質進行了系統地比較（J?Chromatogr?B,2007,848:116-130）。結果表明，MMC層析介質的抗體載量和產品純度均明顯低于蛋白A層析介質。因此，MMC層析介質取代蛋白A層析介質而商用的道路仍然漫長。

解決上述問題的關鍵在于，如何在確保產品收率的前提下，提高MMC層析的處理能力和產品純度。對于一個現有的MMC層析柱而言，層析柱的處理能力與產品的收率和純度之間通常是相互制約的。層析柱處理能力（上樣量）的提升通常是以犧牲產品的收率為代價的。為了提升蛋白A層析柱的處理能力，Mahajan等人提出了一種“半連續”層析分離純化抗體工藝（J?Chromatogr?A,2012,1227:154-162）。這一工藝的特征在于，當蛋白A層析柱（I柱）出口處抗體濃度達到原料液濃度的1%后，在該層析柱后串聯接入一個新的蛋白A層析柱（II柱），以此類推；當I柱出口處抗體濃度達到料液濃度70%時，依次采用清洗緩沖液和洗脫緩沖液沖洗I柱繼而洗脫抗體產品。這種“半連續”層析方法在提高蛋白A層析柱處理能力的同時，產品中宿主蛋白（host?cell?protein，HCP）殘留濃度也隨著蛋白A層析介質的抗體載量的升高而增大。同時，上述“半連續”層析方法的復雜操作的自動化控制更加困難。

發明內容