[發明專利]基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法

有效

• 申請號: 201310413981.8
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103616502A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 沈錫輝;王瑤;崔博宇;宋云洪;王鐵濤;劉應保;司美茹
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于生物科學技術領域，尤其涉及一種基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法。

背景技術

細胞接受外源或是內源的信號，通過其特有的信號途徑，調節其基因的表達，以保持其生物學特性，在這個過程中，蛋白質占有很重要的地位，它可以調控、介導細胞的許多生物學活性，雖然有一些蛋白質可以以單體的形式發揮作用，但是大部分的蛋白質都是和伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質形成復合物來發揮作用的，因此，為了更好地理解細胞的生物學活性，必須很好地理解蛋白質單體和復合物的功能，這就會涉及到蛋白質相互作用的研究，在現代分子生物學中，蛋白質相互作用的研究占有非常重要的地位；

熒光素酶（英文名稱：Luciferase）是生物體內催化熒光素或者脂肪醛氧化發光的一類酶的總稱，由于熒光素酶具有靈敏性高、特異性好、反應迅速、操作簡便、應用廣泛，且對生物體無毒害作用等諸多優點，熒光素酶越來越多的應用于醫學、分子生物學、環境監測等相關領域，其中有一種為細菌體內的熒光素酶，在相應化學反應中，熒光的產生是來自于熒光素的氧化，有些情況下反應體系中也包括三磷酸腺苷（ATP），沒有熒光素酶的情況下，熒光素與氧氣反應的速率非常慢，細菌的發光基因(1uxgene)系統中包括結構基因luxC，luxD，luxA，luxB，luxE和調節基因luxI和luxR等，它們各行使著不同的功能，從不同發光細菌中分離得到的發光基因其種類和數量有所差異，在lux操縱子中，luxA和luxB是緊密相連的；

蛋白質相互作用的研究也已經成為蛋白質組學中最主要研究內容之一,迄今已發展了包括經典的噬菌體展示技術、酵母雙雜交系統以及新發展并廣泛應用的串聯親和純化、表面等離子共振技術等多種有效的研究蛋白質間相互作用的高通量分析方法，為蛋白質組學的發展奠定了堅實的基礎，研究蛋白質相互作用的常規方法還有化學交聯法，免疫共沉淀，細菌雙雜交，GST融合蛋白pulldown實驗，質譜技術，雙分子熒光互補技術等，生物發光共振能量轉移（BRET）技術是近10年來出現的一種新的檢測蛋白質-蛋白質相互作用的技術，它的最大優勢是能在活細胞中實時進行檢測，因此能夠進行相互作用動力學的研究；

BRET技術是基于在某些海生動物體內存在(如海腎螢光素酶)共振能量轉移現象并導致能量供體和能量受體之間非放射性的能量轉移而設計的，這個方法最初用于檢測細菌節律鐘蛋白KaiB相互作用的研究，后來被應用于活的哺乳動物細胞、植物細胞以及芽殖酵母，BRET中能量供體是發光的熒光素酶,在相應的底物存在時發射相應波長的光譜，能量受體是一個熒光蛋白，在一定的波長范圍內吸收外界的光，并在特定范圍內發射更長波長的光，只有供體的發射光譜與受體的吸收光譜相重疊，能量轉移才能發生，根據提供底物不同，熒光供體的發射光波長不同，所以根據供體的發射光波長，選擇合適的熒光受體，從而得到理想的BRET模式體，為了檢測蛋白質與蛋白質相互作用，需將一個誘餌蛋白與能量供體蛋白相融合，另一個靶蛋白與能量受體蛋白相融合，如果兩個融合蛋白不發生相互作用，只能檢測到由能量供體氧化底物所發射的光譜，如果誘餌蛋白和靶蛋白發生相互作用并且供受體之間的距離小于10nm，熒光共振能量轉移發生，則對應的蛋白受體發射的光信號可被檢測到，如果將能量供體蛋白和受體蛋白與同一蛋白相融合，也可以檢測到這個供體和受體融合蛋白分子內的BRET信號，由于能量供體和受體融合的位置不同，分子內的BRET信號可以發生改變，因此，BRET技術也能夠檢測位于目標蛋白內的結構重排現象(構象的改變)。

現有的BRET技術存在的操作復雜，需要選擇合適的熒光受體，反應速率慢。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，旨在解決現有的BRET技術存在的操作復雜，需要選擇合適的熒光受體，檢測準確性低，在原核細胞中檢測不理想的問題。

本發明實施例是這樣實現的，一種基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，該基于細菌熒光素酶BRET檢測蛋白質相互作用的方法包括以下步驟：包括以下步驟：

步驟一，構建克隆pBluescript-pLac::luxAB-MCS；

步驟二，受體蛋白選擇綠色熒光蛋白GFP、增強型黃色熒光蛋白eYFP、橙色熒光蛋白mOrange；

步驟三，在MCS處選擇酶切位點分別將三種熒光蛋白克隆到MCS處；

步驟四，去掉luxB的終止密碼子TAA，形成細菌熒光素酶和熒光蛋白的融合體；