[發明專利]基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法

有效

• 申請號: 201310413981.8
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103616502A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 沈錫輝;王瑤;崔博宇;宋云洪;王鐵濤;劉應保;司美茹
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，其特征在于，該基于細菌熒光素酶BRET檢測蛋白質相互作用的方法包括以下步驟：包括以下步驟：

步驟一，構建克隆pBluescript-pLac::luxAB-MCS；

步驟二，受體蛋白選擇綠色熒光蛋白GFP、增強型黃色熒光蛋白eYFP、橙色熒光蛋白mOrange；

步驟三，在MCS處選擇酶切位點分別將三種熒光蛋白克隆到MCS處；

步驟四，去掉luxB的終止密碼子TAA，形成細菌熒光素酶和熒光蛋白的融合體；

步驟五，分別得到pBluescript-pLac::luxAB-GFP、pBluescript-pLac::luxAB-eYFP、pBluescript-pLac::luxAB-mOramge三個重組載體，產生BRET信號的模式體；

步驟六，通過酶標儀檢測三個BRET信號模式體熒光素酶的熒光強度；

步驟七，選擇三個模式體熒光強度值都較強作為BRET信號產生的熒光供體；

步驟八，通過生物熒光顯微鏡Leica檢測熒光蛋白，選擇合適的熒光受體。

2.如權利要求1所述的基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，其特征在于，在步驟一中，構建克隆pBluescript-pLac::luxAB-MCS的具體步驟為：

首先以pDM4-luxBox含有luxCDABE基因序列，為模板擴增目的基因，PCR的反應體系為50μL：去離子水33.5μL，10×PCRbuffer5μL，dNTPs5μL，MgSO42μL，正反向引物各1.5μL，模板DNA0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，PCR產物用含0.5μg/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，在紫外燈下切下目的條帶，用DNA純化回收試劑盒進行切膠回收。

3.如權利要求2所述的基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，其特征在于，PCR反應程序為：94℃，反應3min；(94℃,30s；50℃,30s,72℃2.5min)30℃xcycles；72℃10min。

4.如權利要求2所述的基于細菌熒光素酶的BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，其特征在于，電泳分離上述PCR產物的條件為：1×TAE緩沖液，電壓5V/cm，電泳40min，切膠回收PCR目的條帶。

5.如權利要求2所述的基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，其特征在于，PCR擴增產物50μL雙酶切反應體系包括：PCR產物20μL，10Xbuffer5μL，限制性內切酶各1μL，ddH₂O補足體積至50μL；同理也是載體50μL酶切體系：8μL載體質粒，10Xbuffer5μL，限制性內切酶各1μL，最后用去離子水補足體積至50μL，酶切后回收。

6.如權利要求2所述的基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，其特征在于，連接反應：連接體系包括目的片段6.5μL，酶切后的載體2.5μL，T4buffer1μL，T4DNA連接酶0.3μL，充分混勻后16°過夜連接。

7.如權利要求1所述的基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，其特征在于，在步驟七中，BRET信號產生的供體選擇明亮發光桿菌的細菌熒光素酶基因luxAB基因來自pDM4-luxBox表達的產物細菌熒光素酶。

8.如權利要求1所述的基于細菌熒光素酶BRET技術檢測蛋白質相互作用的方法，其特征在于，該基于細菌熒光素酶BRET檢測蛋白質相互作用的方法將熒光素酶基因luxAB和eYFP分別克隆到pKT100和pBluescript載體上，并使用Lac啟動子來起始基因的轉錄，得到重組克隆pBluescript-pLac::eYFP和pKT100-pLac::luxAB，然后將luxAB基因和eYFP基因分別與目的蛋白和誘餌蛋白相互融合。