[發明專利]一種環狀芽孢桿菌發酵生產4-乙烯基愈創木酚的方法

有效

• 申請號: 201310413429.9
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103789357A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 董永勝
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22;C12R1/09
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 張貴賓

（一）????????技術領域

????本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種環狀芽孢桿菌發酵生產4-乙烯基愈創木酚的方法。

（二）????????背景技術

4-乙烯基愈創木酚（4-Vinylguaiaco1，4-VG）又名2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、對乙烯基愈創木酚，分子式為C₉H₁₀O₂，分子量為150.18，為無色或淡黃色的油狀液體，略帶甜味，呈發酵香氣。4-VG是一種能產生特殊香味或丁香類香味的揮發性酚類物質，其感覺閾值很低，僅為0.3mg/L，它能提高食品的感官品質，對酒類、醬油、干酪、飲料等食品的自然香氣有很大影響。4-VG是一種常用的高檔香料，主要用于食品以增加其香味成份，還用于煙草、日化、醫藥、香精合成等行業。在釀酒行業，4-VG是以小麥類為原輔料的上面發酵啤酒中必不可少的香味物質，也是醬香型白酒和葡萄酒中的一種重要的風味物質。

4-乙烯基愈創木酚的生產方法有從植物中直接提取法、化學合成法和生物合成法三種。植物提取法是從菊科、旋花科等植物中提取，但由于原料供應有限，且植物中4-VG的含量較低，導致提取工藝成本較高而難以實現大規模生產。

化學合成法是常用的生產4-VG的方法，如中國專利文獻CN?101885669?A（申請號?201010229531.X）公開了一種4-乙烯基愈創木酚的制備方法，步驟為：（1）向反應器中依次投入喹啉、阿魏酸和作為阻聚劑的對苯二酚，加熱，溫度升高到180-185℃時，反應4-5小時左右；（2）將上述反應液中加入溶劑苯，并加入鹽酸，攪拌均勻，靜置分層，檢測水相pH值為中性為止，最后加入干燥劑無水氯化鈣；（3）將干燥后的溶液放入蒸餾器中，常壓將作為溶劑的苯蒸出，然后連接上真空泵在100℃以下的氣相溫度下將產品蒸出，即可包裝市售。但化學合成法普遍存在較嚴峻的環保問題，反應條件一般較劇烈，對設備要求較高，生產工藝復雜，產品收率低；并且由于產品中含有原料、副產物、溶劑等物質的殘留物，因此該方法得到的4-VG無法直接添加到食品中。

隨著人們對綠色產品要求的日益提高，利用生物工程技術生產4-VG的方法具有產品綠色天然、安全可靠、反應條件溫和、環境污染小等優點而受到人們的重視。生物合成法是通過培養含有阿魏酸脫羧酶的微生物細胞或通過采用阿魏酸脫羧酶制劑進行催化合成4-VG的方法。與植物提取法和化學合成方相比，生物合成法具有原料來源廣泛、副產物少、產品收率高、生產成本低、易于實現工業化的特點，是一種經濟有效和極有產業化前景的4-乙烯基愈創木酚生產方法。

如中國專利文獻CN?102776246?A（申請號?201210288911.X）公開了一種生物轉化制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法，該方法以芽孢桿菌Bacillus?sp.HY3CCTCCM2012247為生物催化劑，以天然阿魏酸為底物，通過微生物轉化制備天然4-乙烯基愈創木酚。其生產過程包括：（1）斜面培養,（2）制備種子培養液，（3）轉化細胞培養,（4）轉化。該發明是在微生物的作用下將天然阿魏酸轉化制備4-乙烯基愈創木酚，但天然阿魏酸是從植物（如谷糠、阿魏等）中提取得到的，由于提取成本較高，因此采用該方法生產4-VG的成本也較高。

許多微生物（如參與酒類釀造的酵母菌、細菌、真菌等）能夠利用培養基中的營養物質發酵產生4-乙烯基愈創木酚，但由于這些微生物細胞內的阿魏酸脫羧酶活性較低，產生的4-VG含量較低（一般在2.0-5.0mg/L），因而不能滿足工業化生產的要求。

（三）????????發明內容

????本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種產率高、成本低、能夠規模化生產的環狀芽孢桿菌發酵生產4-乙烯基愈創木酚的方法。

本發明是通過如下技術方案實現的：

一種環狀芽孢桿菌發酵生產4-乙烯基愈創木酚的方法，以菌種保藏編號為CGMCC?No.8044的環狀芽孢桿菌（Bacillus?circulans）HG12菌株為生產菌種，包括如下步驟：

（1）從試管斜面上挑取1-2環環狀芽孢桿菌HG12菌體接種到液體種子培養基中，在35-40℃、120-160r/min條件下，培養12-16h，制得活化后的液體種子；

（2）將液體種子按體積比為3-5%的接種量接種到液體發酵培養基中，發酵10-12h，加入木聚糖酶，繼續發酵10-12h，加入阿魏酸酯酶，再發酵60-72h制得含有4-乙烯基愈創木酚的發酵液；