[發明專利]一種調控鐵皮石斛懸浮細胞多糖含量增加的方法

無效

• 申請號: 201310412811.8
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103430852A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 蘇劉花
• 申請（專利權）人: 南京澤朗農業發展有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及稀土調控鐵皮石斛懸浮細胞多糖含量增加的方法。

背景技術

鐵皮石斛Dendrobium?officinale?Kimura?et?Migo是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，主要分布于西南和江南各省，為我國傳統常用中藥，石斛的藥用部分是莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效。由于種子極小、無胚乳，自然繁殖率低，很難用實生苗栽培；而傳統的分株、扦插等方式的繁殖率亦極低，近些年來，人為的過度采挖和破壞其適生環境，其資源已瀕臨滅絕，是資源最為缺乏的一種，在1989年被國家列為重點保護的藥用植物之一。鐵皮石斛主要有效成分為石斛類多糖及生物堿，另外還有酚類、菲類、芪類、倍半萜類及香豆素等，其主要藥效成分為多糖，且含量較高，現代藥理研究報導石斛多糖具有抗腫瘤、增強免疫力、降低血糖等作用。

鑭是17種稀土元素中最重要和最活潑的元素，適當濃度La³⁺對幼苗的生長起積極作用，研究表明La³⁺與Ca²⁺的半徑相似，化學性質上可能存在著競爭作用。La³⁺和Ca²⁺的作用相似，能夠取代Ca²⁺在細胞膜上的位置，并在一定的條件下產生與Ca²⁺相似的作用。可以提高蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，可以作為植物光合作用的催化劑，促進植株的生長，提高幼苗干重。近年來的研究發現稀土亦具有抗寒、抗旱等抗脅迫的能力，試驗證明稀土元素能促進植物細胞培養中次級代謝產物的積累，鑭、鈰對東北紅豆杉懸浮細胞中紫杉醇合成與釋放具有一定作用，稀土離子可以通過不同方式與酶結合，從而影響酶的活性。稀土元素能提高植物細胞中次級代謝產物的含量可能與它們影響多種酶的活性有關。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供鐵皮石斛懸浮培養的快速繁殖方法，并通過稀土對其進行調控獲得生長良好，多糖含量高的細胞，進行工業大規模生產，可以規模化的為藥廠提供鐵皮石斛多糖的來源。

為解決上述技術問題，本發明采用下列技術方案：

野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養基上，附加激素NAA?1mg/L，IBA?2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導愈傷組織，誘導30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入White+TDZ1mg/l+IAA0.5mg/l，進行懸浮細胞培養，繼代3次后，在培養基中加入2mg/l稀土，進行細胞多糖含量的調控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時間為7.5?h，料液比為1：20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進行純化。D₃₀₁R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進行檢測，多糖得率28%。

所述培養基消毒方式為在121℃下滅菌20min。

所述外植體的消毒方法為取鐵皮石斛葉片，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗50分鐘，經次氯酸鈉消毒處理12分鐘，無菌水沖洗5遍。

所述的稀土優選是硝酸鑭稀土。

所述多糖提取方法采用水提法提取，精密度RSD%為3.12%，重現性RSD%值為1.83%，穩定性RSD%值為3.8%。

所述多糖測定方法為苯酚-硫酸法對鐵皮石斛多糖進行檢測，以葡萄糖標準液繪制標準曲線，加入1.5mL5%的苯酚溶液，硫酸5mL，顯色溫度80℃，在水浴中加熱30min，在波長488nm下測定鐵皮石斛多糖的含量，此種方法快速、顯色穩定、重現性好、適用于鐵皮石斛多糖含量的測定。

所述純化方法采用D₃₀₁R樹脂對多糖進行純化，吸附液25℃，濃度5mg·mL^－1，pH為7.0，吸附流度為1.8mL·min^－1時吸附較強。

采用本發明制備的鐵皮石斛懸浮細胞，增值速度快，多糖含量高，利于大生產操作，能耗小，污染小。

下面將結合具體實施方式對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。

具體實施方式

實施例1