[發(fā)明專(zhuān)利]腸炎沙門(mén)氏菌菌體及核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310411939.2
• 申請(qǐng)日: 2013-09-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103627790A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃曉蓉;柯璐;鄭晶;林杰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及腸炎沙門(mén)氏菌菌體及核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。

背景技術(shù)

腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella?enteritidis?，SE）是引起食物中毒的常見(jiàn)致病菌，在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義，家禽、蛋及肉類(lèi)產(chǎn)品是SE的主要傳播媒介，嚴(yán)重影響著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類(lèi)健康，因此對(duì)易受SE污染的食品在流入市場(chǎng)前應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)。

動(dòng)物性食品安全問(wèn)題被作為一個(gè)社會(huì)健康問(wèn)題受到廣泛的關(guān)注，與之相應(yīng)的檢測(cè)能力也正在不斷提高，安全檢測(cè)技術(shù)朝準(zhǔn)確、快速、便捷的方向研發(fā)。檢測(cè)工具，新的設(shè)備和試劑盒層出不窮，尤其是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面更是研制出了各種新型的快速檢測(cè)試劑盒，在提高沙門(mén)氏菌的檢測(cè)速度，簡(jiǎn)化樣品處理的繁雜步驟的同時(shí)降低了檢測(cè)人員的操作要求，使其對(duì)試劑盒的利用產(chǎn)生依賴(lài)性。然而檢測(cè)用試劑盒被廣泛應(yīng)用于市場(chǎng)，卻沒(méi)有統(tǒng)一的管理系統(tǒng)和規(guī)范的參照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，造成這些試劑盒在質(zhì)量上出現(xiàn)參差不齊的狀況，表現(xiàn)在靈敏度、特異性和穩(wěn)定性有所差異，使得各實(shí)驗(yàn)室間/各檢測(cè)人員間檢測(cè)結(jié)果在真實(shí)性上得不到保障，難免出現(xiàn)動(dòng)物性食品中腸炎沙門(mén)氏菌的錯(cuò)檢或漏檢，不僅有可能導(dǎo)致我國(guó)進(jìn)出口在國(guó)際貿(mào)易中發(fā)生重大經(jīng)濟(jì)損失，還有可能對(duì)人類(lèi)的健康造成威脅。而目前，我國(guó)在動(dòng)物性食品安全檢測(cè)試劑盒上的管理基本處于空白，為了在提高腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)效率的同時(shí)保障實(shí)驗(yàn)室間以及檢測(cè)人員間的檢測(cè)能力，確保檢測(cè)結(jié)果的有效性，必須規(guī)范對(duì)試劑盒產(chǎn)品的使用，填補(bǔ)管理上的空白，因此，研發(fā)可用于試劑盒和日常檢測(cè)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)勢(shì)在必行。

????然而，目前無(wú)論國(guó)內(nèi)外對(duì)食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究甚少，對(duì)于微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究制備還是處于起步階段，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)值的研制開(kāi)始于20世紀(jì)80年代，研究至今我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)雖已基本滿足經(jīng)濟(jì)建設(shè)的需要，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和新型材料設(shè)備的不斷涌現(xiàn)，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)品種已不能完全滿足需求，尤其是在生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)范圍，我國(guó)研制的與食品分析有關(guān)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約390種，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，主要用在食品安全、營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)、環(huán)境衛(wèi)生評(píng)價(jià)等方面。雖然我國(guó)在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究上經(jīng)過(guò)了20多年的研究，但是依然存在以下問(wèn)題：種類(lèi)少、重復(fù)研制現(xiàn)象多，在與微生物、畜禽等相關(guān)的成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究上還相對(duì)空白，研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)準(zhǔn)確度不高，且很多標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不能提供出不確定度的參考信息。

生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分為生物成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。菌種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及菌種核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中較為特殊的一類(lèi)，是生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究的重要內(nèi)容之一。而目前與微生物、畜禽等相關(guān)的成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究上還相對(duì)空白，研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)準(zhǔn)確度不高，且很多標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不能提供出不確定度的參考信息。

為確保檢驗(yàn)人員的檢測(cè)能力、規(guī)范試劑盒的管理，降低食品中SE的檢漏和檢錯(cuò)率，應(yīng)加大力度研制相關(guān)的生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以使SE檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為鑒定、評(píng)價(jià)、分析、安全監(jiān)控食品中腸炎沙門(mén)氏菌提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并為生物成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備及驗(yàn)證提供參考價(jià)值。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種腸炎沙門(mén)氏菌菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：包括腸炎沙門(mén)氏菌的液體培養(yǎng)、雞肉基質(zhì)前處理、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝與儲(chǔ)存、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值。具體步驟如下：

（1）腸炎沙門(mén)氏菌的液體培養(yǎng)

挑取單菌落于6mL無(wú)菌水中，渦旋振蕩器上混勻，吸取1mL菌懸液于盛有100mLBPW增菌液的錐形瓶中，36±1℃培養(yǎng)22h；

（2）雞肉基質(zhì)前處理

雞肉切成小塊，并用剪刀挑除非肉組織，用高速組織搗碎機(jī)攪碎10min至肉糜狀，收集肉糜500g/袋分裝于均質(zhì)袋，用拍擊式均質(zhì)器勻質(zhì)3min后保存，選擇高壓蒸汽121℃，滅菌15min或鈷-60滅菌，計(jì)量為6KGY；

（3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

根據(jù)腸炎沙門(mén)氏菌液體培養(yǎng)的OD₆₀₀值，用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋至10³級(jí)，將保護(hù)劑與稀釋至10³級(jí)的新鮮菌懸液按照5:1比例配制混合液，測(cè)定其pH值并用0.2M的NaOH調(diào)pH至7±0.1，于無(wú)菌均質(zhì)袋中與25g雞肉基質(zhì)混合后，于拍擊式均質(zhì)器上拍擊10s，倒入已滅菌的50mLPP瓶，輕輕旋上瓶蓋，將制備好的樣品于-70℃預(yù)凍5h后凍干；

（4）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝與儲(chǔ)存

凍干后的樣品，連PP瓶一同裝入鋁箔袋中，在真空封口機(jī)上封口，制備好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于-20℃保存；