[發明專利]腸炎沙門氏菌菌體及核酸標準物質的制備方法

有效

• 申請號: 201310411939.2
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103627790A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 黃曉蓉;柯璐;鄭晶;林杰
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種腸炎沙門氏菌菌體標準物質的制備方法，其特征在于：包括腸炎沙門氏菌的液體培養、雞肉基質前處理、標準物質的制備、標準物質的包裝與儲存、標準物質的定值。

2.根據權利要求1所述的腸炎沙門氏菌菌體標準物質的制備方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）腸炎沙門氏菌的液體培養

挑取單菌落于6mL無菌水中，渦旋振蕩器上混勻，吸取1mL菌懸液于盛有100mLBPW增菌液的錐形瓶中，36±1℃培養22h；

（2）雞肉基質前處理

雞肉切成小塊，挑除非肉組織，攪碎至肉糜狀，收集于均質袋，用拍擊式均質器勻質后保存，選擇高壓蒸汽121℃，滅菌15min或鈷-60滅菌，計量為6KGY；

（3）標準物質的制備

根據腸炎沙門氏菌液體培養的OD₆₀₀，用無菌生理鹽水將其稀釋至10³級，將保護劑與稀釋至10³級的新鮮菌懸液按照5:1比例配制混合液，測定其pH值并調pH值至7±0.1，于無菌均質袋中與25g基質混合后，均質器上拍擊10s，倒入已滅菌的50mLPP瓶，輕輕旋上瓶蓋，將制備好的樣品于-70℃預凍5h后凍干；

（4）標準物質的包裝與儲存

凍干后的樣品，連PP瓶一同裝入鋁箔袋中，在真空封口機上封口，制備好的標準物質于-20℃保存；

（5）標準物質的定值

用無菌水對凍干物進行溶解復原，靜置后全部倒入無菌帶濾膜均質袋中，吸取25mL無菌磷酸鹽緩沖液混合，拍擊均質，制成初始菌懸液；用移液管吸取500μL初始懸浮液的濾過部分于沙門氏菌顯色培養基，涂布平板，靜置，使液體被瓊脂吸收后倒置放入培養箱中培養，36±1℃培養18~24h，計數典型菌落數，即為標準值；定值結果表示為：標準值±總不確定度。

3.根據權利要求2所述的腸炎沙門氏菌菌體標準物質的制備方法，其特征在于：所述的步驟（3）中保護劑配方為20%脫脂奶+10%蔗糖+3%L-谷氨酸鈉-水+純水，pH=6.7±0.1。

4.一種腸炎沙門氏菌核酸標準物質的制備方法，其特征在于：包括總gDNA的提取、總gDNA的特征性驗證、SE-gDNA?標準物質的制備、SE-gDNA?標準物質的包裝與儲存、標準物質的定值。

5.根據權利要求4所述的腸炎沙門氏菌核酸標準物質的制備方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）?總gDNA的提取

????取新鮮菌液，菌濃度達到0.5-1.5×10⁹cells，提取gDNA，并進行gDNA純度和濃度的初檢測，將提取的符合要求的gDNA溶液合并混勻，利用熒光儀結合PicoGreen染料對提取的總gDNA進行濃度的測定；

（2）?總gDNA的特征性驗證

以invA-1、invA-2作為引物，?PCR擴增后進行凝膠電泳，另取10μL的總gDNA溶液進行核酸凝膠電泳；對總gDNA的PCR反應產物進行純化，回收純化的樣品進行克隆測序；

（3）?SE-gDNA?標準物質的制備

???將符合標準物質制備要求的總gDNA溶液用TE溶液稀釋至適當濃度，用已滅菌的小型離心管分裝，使每支gDNA含量為1μg；于-70℃預凍6h后，置于冷凍干燥機凍干；

（4）SE-gDNA?標準物質的包裝與儲存

將凍干好的樣品放入塑料袋中，立即用封口機封口，貯存于-20℃；

（5）標準物質的定值

利用熒光值法進行定值，定值結果表示為：標準值±總不確定度。

6.根據權利要求5所述的腸炎沙門氏菌核酸標準物質的制備方法，其特征在于：所述的步驟（1）總gDNA提取的純度在1.75-1.90，濃度在70-100μg/mL范圍內。

7.根據權利要求5所述的一種腸炎沙門氏菌核酸標準物質的制備方法，其特征在于：所述的步驟（2）引物invA-1、invA-2的序列為：

invA-1：5'-GTGA?AATT?TACG?CCAC?GTTC?GGGC?AA-3'??；

invA-2：5'-TCAT?CGCA?CCGT?CAAA?GGAA?CC-3'??。