[發(fā)明專利]香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段、編碼蛋白及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310410779.X
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103898128A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃敏;張偉;鐘民濤;倫永志;劉奔;李星云;王曉麗;曹婧;寧安紅
• 申請（專利權(quán)）人: 大連醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/375;A61P35/00;C12N15/10
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-16基因片段、編碼蛋白及制備方法，所編碼的蛋白具有核糖核酸內(nèi)切酶L-PSP結(jié)構(gòu)域，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抗腫瘤等功能。?

背景技術(shù)

真菌富含多種生物活性分子，包括核糖體失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素樣蛋白、多糖和激酶。其中的抗腫瘤成分以不良反應(yīng)少、療效顯著等優(yōu)點在腫瘤治療方面具有獨到之處。香菇菌C91-3屬真菌，為擔(dān)子菌亞門擔(dān)子菌綱側(cè)耳科，該菌種已于2013年保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益氣，扶正祛邪，增強機(jī)體免疫力，防治癌癥等功效。[Zhao?C，Sun?H，Tong?X，et?a1．An?Antitumor?lectin?from?edible?Mushroom?Agrocybe?aegerita[J]．Biochem?J，2003，374：321-327]。香菇菌C91-3發(fā)酵液中含有多種蛋白成分，通過動物體內(nèi)實驗證實有些蛋白成分具有較好的抗腫瘤作用[黃敏，寧安紅，張卓然等．香菇C91-3菌絲發(fā)酵液小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用的研究[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，1996，8(3)：38-160]。體外實驗也證實，其發(fā)酵液中的一些蛋白組分具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力[戴兵,黃敏,寧安紅.香菇C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白抑制小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14生長及誘導(dǎo)凋亡的實驗研究.浙江醫(yī)學(xué)，2004，26（9）；656?-658]。但是，迄今為止還沒有關(guān)于從香菇C91-3菌中提取可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的基因片段、編碼蛋白及制備方法等相關(guān)報道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述問題，提供一種從香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-16基因片段、編碼蛋白及制備方法，所編碼的蛋白具有核糖核酸內(nèi)切酶L-PSP結(jié)構(gòu)域，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抗腫瘤等功能。?

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段，其特征在于如SEQ?ID?NO：1?所示的核苷酸序列。?

一種上述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段編碼蛋白，其特征在于如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。?

一種上述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行：?

a.?提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA；

b.?將菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

c.??PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因：

以所得到的cDNA為模板、以具有EcoRⅠ?和?XhoⅠ兩個酶切位點的PCR反應(yīng)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)引物序列如下：

上游引物EcoRⅠ：

5'-?GCGAATTCACCAACAATGCATCCGGTG?-3'?

下游引物XhoⅠ：

5'-?GCTCGAGATTACAAGAGCGCTCAGTA?-3'

d.?回收純化DNA片段：

將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化231bp?Marker附近的明顯條帶，切膠回收DNA片段。

所述a步驟是取培養(yǎng)18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續(xù)研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，然后加入1/5體積氯仿，溫和振蕩后，4?C,?12000r/min離心，15min；吸取上層水相溶液并轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜止15min，再次4?C，12000r/min離心，10min，棄上清，然后加入75%乙醇洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA。?