[發明專利]香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段、編碼蛋白及制備方法

有效

• 申請號: 201310410779.X
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103898128A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 黃敏;張偉;鐘民濤;倫永志;劉奔;李星云;王曉麗;曹婧;寧安紅
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/375;A61P35/00;C12N15/10
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段，其特征在于如SEQ?ID?NO：1?所示的核苷酸序列。

2.一種如權利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段編碼蛋白，其特征在于如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。

3.一種如權利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進行：

a.?提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA；

b.?將菌絲體總RNA反轉錄合成cDNA；

c.?PCR擴增目標基因：

以所得到的cDNA為模板、以具有EcoRⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點的PCR反應引物進行PCR反應；所述PCR反應引物序列如下：

上游引物EcoRⅠ：

5'-?GCGAATTCACCAACAATGCATCCGGTG?-3'?

下游引物XhoⅠ：

5'-?GCTCGAGATTACAAGAGCGCTCAGTA?-3'?

d.回收純化DNA片段：

將所得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化231bp?Marker附近的明顯條帶，切膠回收DNA片段。

4.根據權利要求3所述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段的制備方法，其特征在于所述a步驟是取培養18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后，12000r/min離心5min，將上清轉移至新的離心管中，然后加入1/5體積氯仿，溫和振蕩后，4?C,?12000rpm離心，15min；吸取上層水相溶液并轉移至另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置15min，再次4?C，12000rpm離心，10min，棄上清，然后加入75%乙醇洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA。

5.根據權利要求4所述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段的制備方法，其特征在于所述c步驟的PCR反應體系50?μl：?cDNA模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，dNTP?Mixture?4?μl、5×PrimeSTAR?Buffer?10?μl、PrimeSTAR?HS?DNA?Polymerase（2.5?U/μl）0.5?μl、滅菌蒸餾水33.5μl；反應條件：98℃變性10s，56℃復性10s，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸5min；4℃冷卻10min。