[發明專利]黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位方法

有效

• 申請號: 201310409784.9
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN104419763B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 婁群峰;張云霞;陳勁楓;何玉華;賈利;程春燕;李季
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明公開了利用熒光原位雜交技術直接將黃瓜單拷貝基因在染色體上進行物理定位的方法，有利于開展黃瓜的細胞遺傳學研究，屬于植物生物技術領域。

二、技術背景

黃瓜(Cucumis?sativus?L.，2n＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黃瓜具有一些特殊的性狀，如性別表型多樣化、線粒體的父性遺傳性等；同時黃瓜的基因組相對較小(約370Mb)，染色體數目少，僅為14條，使得黃瓜成為近年來分子細胞遺傳學研究的模式物種之一。

細胞遺傳圖譜是指遺傳上標記的探針在染色體上的位置，涉及了細胞學上的標志，例如著絲粒、端粒、異染色質區和核仁組織區等。伴隨著基因組研究的進步，細胞遺傳圖譜不僅對于整合遺傳、分子和細胞學的信息具有重要的價值，并且能為染色體水平上觀察基因組結構提供一種獨特的研究思路。

基因或特定序列的染色體物理定位是細胞遺傳相關研究的重要內容之一。傳統的FISH技術對目標片段長度有一定的要求，一般片段至少在10kb以上才能檢測到可見的信號。目前基因染色體物理定位的主要方法是利用包含該基因的大片段克隆進行染色體熒光原位雜交，從而進行相應基因的物理定位，這些大片段克隆主要有BAC、Fosmid等。該方法依賴于大片段文庫的構建、以及利用相應的分子標記篩選獲得特寫的克隆，才能用于基因的物理定位。

構建細胞遺傳圖譜最直接、最有效的方式是通過FISH直接將單拷貝基因定位到染色體上，多數基因的長度在10kb以下，這對FISH的檢測精度提出了新的挑戰。在植物染色體上，短片段序列的檢測更為很難，主要是由于植物細胞壁碎片和濃厚的細胞質不易去除，背景較高，同時阻止了靶DNA的順利進入，最終導致了相對低的信噪比。迄今，單拷貝基因的FISH檢測僅來自于少數幾個實驗室的報道。例如Fransz等人(1996年)在矮牽牛的有絲分裂中期染色體上用1.4kb大小的探針定位了查耳酮合酶基因A；Ohmido等人(1998年)在水稻有絲分裂中期染色體上定位了一個1.29kb大小的序列；Wang(2006)等在玉米粗線期染色體上能檢測到3kb的基因信號。然而，由于技術上的難度，單拷貝基因的染色體物理定位在植物中仍未見廣泛的應用。

目前，單拷貝基因在黃瓜中期和粗線期染色體上的定位仍未見報道，我們通過改進制片技術，并利用純化的單拷貝基因進行FISH檢測，能在染色體上看到明顯的單拷貝基因的信號，最小能檢測到2Kb的基因片段，從而實現了單拷貝基因在染色體上的直接物理定位。

三、發明內容

技術問題

本發明黃瓜單拷貝基因在染色體上的物理定位方法的目的，是針對以往黃瓜單拷貝基因無法在黃瓜染色體上進行直接定位等缺陷，發明能通過FISH在黃瓜中期和粗線期染色體上檢測到小至2kb長度的單拷貝基因的信號，為制作高分辨率的黃瓜染色體的物理圖譜奠定了基礎，加快了黃瓜的細胞遺傳學研究進展。

技術方案

本發明所提供的黃瓜單拷貝基因在染色體上的物理定位，其特征在于：在黃瓜中期和粗線期染色體上觀察到了清晰明顯的且片段小至2kb的單拷貝基因探針的信號。

上述黃瓜單拷貝基因能夠定位在染色體上，是通過以下方法獲得的：

取黃瓜植株根尖以及盛花前期和盛花期大小的花蕾，分別用固定液固定備用。

取出固定好的根尖和花蕾，處理之后酶解，然后用涂片法制片，鏡檢，進一步用胃蛋白酶進行細胞質的去除，然后用乙醇梯度干燥，備用。

根據黃瓜基因組數據庫，隨機選擇黃瓜單拷貝基因，利用Primer5.0設計引物，利用長片段Taq酶進行PCR擴增，擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳，然后進行切膠回收。

將得到的回收產物作為DNA模版，再進行二次PCR擴增。

將二次PCR產物標成探針備用，通過FISH，將探針雜交到黃瓜染色體上，在熒光顯微鏡下觀察信號。

有益效果

本發明與現有技術相比，具有如下優點和積極效果：

1)黃瓜單拷貝基因通過FISH能夠在黃瓜中期和粗線期染色體檢測到信號(圖1和2)，且檢測到的探針信號的最小片段小于2kb(圖4)，與現有技術相比，充分提高了靶信號的靈敏度。

2)現有的技術在定位目標基因時，主要利用大片段文庫進行FISH定位，這需要事先構建好相應的文庫，需要特定的條件。同時還需要在文庫中篩選獲得包含目標基因的克隆，程序相當繁瑣。而使用現在的方法可以直接進行基因的定位，檢測到的最小探針長度為2kb，適合于絕大多數基因的定位需要。