[發明專利]采用EST-SSR標記進行花椰菜品種鑒定的方法

在審

• 申請號: 201310409457.3
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN104419762A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 趙新;劉莉莉;王永;王超楠;蘭青闊;李梅;陳銳;朱珠;郭永澤;景海春
• 申請（專利權）人: 天津市農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于農業的蔬菜育種與應用技術領域，具體涉及13份花椰菜雜交種品種鑒定方法，是一種基于EST-SSR標記的高效、簡便進行花椰菜品種鑒定的方法。

背景技術

花椰菜屬于甘藍的變種，為十字花科植物，是一種很受人們歡迎的蔬菜，味道鮮美，營養豐富，同時具有很高的藥用價值，目前我國南北各地均有種植。中國市場花椰菜品種為常規種與雜交種并存狀態，同名異物及同物異名現象比較普遍，而花椰菜品種田間形態學上的鑒別易受環境和人為因素的影響，再加上生長期長，因此進行花椰菜優良性狀早期鑒定和遺傳關系研究十分必要。

隨著分子生物學技術的發展，遺傳多樣性不僅是表現在表型性狀上的差異，更重要的是表現在DNA水平上的差異。分子標記的發展為從DNA水平上檢測品種及品系間的遺傳多樣性提供了有利的工具。EST(Expressed?sequence?tags)即表達序列標簽，是指通過對cDNA文庫隨機挑取的克隆進行大規模測序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長度一般為150～500bp。EST計劃由美國科學家Venter于1989年首次提出，并首先應用于人類基因組的研究，之后被廣泛用于植物基因組的研究。隨著EST計劃在不同物種間的不斷擴展和深入研究，數據庫中已積累了大量的EST，為SSR標記的開發帶來了新的契機，已成為SSR標記的重要來源。為了區別于傳統的gSSR，一般將來源于EST庫的SSR標記稱為EST-SSR標記，該標記的顯著特點是來自基因組的轉錄區域，同時信息量較高，開發過程既簡單又快捷，費用低、通用性好，而且效率也高。因此，EST-SSR作為共顯性標記與其他分子標記相比具有諸多優點。

目前EST-SSR標記已經應用于水稻(Cho?et?al.，2000)、葡萄(Scott?et?al.，2000)、小麥(Gupta?et?al.，2003；Gao?et?al.，2004；Nicot?et?al.，2004)、黑麥(Hackauf?et?al.，2002)、大麥(Thiel?et?al.，2003)和扁桃(Xu?et?al.，2004)、玉米(Wang?and?Bowen，1998)、甘蔗(Cordeiro?et?al.，2001)等植物進行分子連鎖圖譜構建和遺傳多樣性分析。

發明內容

本發明的目的在于公開了一種采用EST-SSR標記進行花椰菜品種鑒定的方法，為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案：

用于花椰菜品種鑒定的EST-SSR引物，其特征在于，包括5對EST-SSR引物：

HYC33上游引物序列：5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3’，HYC33下游引物序列：5’-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3’；BC5上游引物序列：5’-CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3’，BC5下游引物序列：5’-CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3’；HYC10上游引物序列：5’-CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3’，HYC10下游引物序列：5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3’；BC20上游引物序列：5'-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3’，BC20下游引物序列：5’-GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3’；BC28上游引物序列：5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3’，BC28下游引物序列：5’-GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3’。

本發明進一步公開了采用EST-SSR標記進行花椰菜品種鑒定的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)采用權利要求1所述的EST-SSR引物對供試品種樣品模板DNA進行PCR擴增，其中的PCR擴增反應的總體積為10μL，擴增反應體系為：2×Master?Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供試品種花椰菜雜交種基因組DNA模板，濃度100ng/μL，1μL，雙蒸水補足10μL；PCR反應程序為95℃預變性2min，32個擴增循環(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存；

(2)對PCR擴增產物進行凝膠電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％，凝膠組分為：去離子水21mL，10×TBE3mL，40％PAG6mL，TEMED30μL，10％過流酰胺300μL；設定電壓250V，電泳1h，關閉電源，進行染色；染色過程：銀染8～10min，迅速水洗，NaOH顯色數分鐘，直至條帶清晰即可，再次水洗；