[發明專利]采用EST-SSR標記進行花椰菜品種鑒定的方法

在審

• 申請號: 201310409457.3
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN104419762A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 趙新;劉莉莉;王永;王超楠;蘭青闊;李梅;陳銳;朱珠;郭永澤;景海春
• 申請（專利權）人: 天津市農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.用于花椰菜品種鑒定的EST-SSR引物，其特征在于，包括5對EST-SSR引物：

HYC33上游引物序列：5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3’，HYC33下游引物序列：5'-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3’BC5上游引物序列：5'-CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3’，BC5下游引物序列：5’-CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3’；HYC10上游引物序列：5’-CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3’，HYC10下游引物序列：5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3’；BC20上游引物序列：5’-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3’，BC20下游引物序列：5'-GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3’；BC28上游引物序列：5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3’，BC28下游引物序列：5'-GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3’。

2.一種采用EST-SSR標記進行花椰菜品種鑒定的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)采用權利要求1所述的EST-SSR引物對供試品種樣品模板DNA進行PCR擴增，其中的PCR擴增反應的總體積為10μL，擴增反應體系為：2×Master?Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供試品種花椰菜雜交種基因組DNA模板，濃度100ng/μL，1μL，雙蒸水補足10μL；PCR反應程序為95℃預變性2min；32個擴增循環，94℃40sec，56℃45sec，72℃1min；72℃延伸7min，4℃保存；

(2)對PCR擴增產物進行凝膠電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％，凝膠組分為：去離子水21mL，10×TBE3mL，40％PAG6mL，TEMED30μL，10％過流酰胺300μL；設定電壓250V，電泳1h，關閉電源，進行染色；染色過程：銀染8～10min，迅速水洗，NaOH顯色數分鐘，直至條帶清晰即可，再次水洗；

(3)通過分析EST-SSR結果，比較13份花椰菜品種間多態性位點的差異，確定引物的多態率及多態信息量；在相同遷移率位置上進行“1，0”標注，構建13份花椰菜品種的SSR分析譜帶數據，通過數據分析5對引物是否可對13份花椰菜品種進行完全的區分，同時構建13份花椰菜品種的指紋圖譜。