[發明專利]一種Hsa-miR-145-5p試劑盒及其成熟體模擬物的應用

有效

• 申請號: 201310408755.0
• 申請日: 2013-09-10
• 公開（公告）號: CN103667441B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發明（設計）人: 王斌全;高偉;張春明;陳鋼鋼;皇甫輝;溫樹信;馮彥
• 申請（專利權）人: 山西醫科大學第一醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N33/68
• 代理公司: 太原華弈知識產權代理事務所 14108
• 代理人: 李毅

技術領域????

本發明涉及一種人屬微小RNA，具體涉及一種Hsa-miR-145-5p試劑盒及其成熟體模擬物的應用。

背景技術

頭頸鱗癌為全世界第六位高發腫瘤，位居歐洲男性高發腫瘤的第4位，而喉鱗癌（laryngeal?squamous?cell?carcinoma，LSCC）源于喉黏膜上皮，發病率居頭頸鱗癌的第2位。據統計，目前全世界范圍內喉鱗癌發病略有上升，且年輕化趨勢逐漸顯現。?

喉解剖結構局限且黏膜下淋巴管豐富，因此喉鱗癌具有局部侵襲及頸淋巴結轉移的惡性生物學特性，成為患者治療后復發及預后不良的重要風險因素，這也是近30年來喉鱗癌5年生存率并未有明顯提升的一個重要因素。在喉鱗癌侵襲轉移的過程中勢必伴有一些抑癌基因和/或癌基因的異常表達，如抑癌基因的下調表達，癌基因的上調表達。因此探索這些與喉鱗癌侵襲轉移相關的基因表達紊亂的分子生物學機制著重要的臨床意義。?

microRNAs（miRNAs）是目前新發現的一類長度約為22nt的內源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，它能夠與其相應靶基因信使RNA（mRNA）的3’端非翻譯區（3’-UTR區）結合，從而降解mRNA或抑制其翻譯。研究表明miRNAs與腫瘤關系密切，充當癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤細胞生長、增殖、分化、凋亡、惡性間質轉化、干細胞分化等方面發揮重要作用。?

目前發現人類基因組編碼多達2000多種不同的miRNAs，miRNA調控基因組約30%編碼基因的表達。研究顯示約50%的miRNA位于腫瘤相關的基因組區域或脆性位點，且不同類型腫瘤中miRNA表達譜存在較大差異。一些miRNA在惡性腫瘤中表達上調，這類miRNAs能通過抑制腫瘤抑制基因或控制細胞周期進程、分化或凋亡的基因，刺激細胞增殖及血管生成，促進腫瘤發生，這類miRNAs具有癌基因的作用，因此被稱為致癌性miRNA。與致癌性miRNA相反，在惡性腫瘤中表達下調的一些miRNAs可能通過負向調控癌基因和/或負向調控抑制細胞分化或凋亡的基因發揮抑癌基因的作用，稱為抑癌性miRNA。?

越來越多的研究表明，具有致癌或抑癌作用的miRNA分子參與了包括肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、腦腫瘤及白血病在內的多種腫瘤的發生、發展。迄今，miRNA的功能與癌癥形成的相關性研究已成為國內外的熱點方向。目前在喉鱗癌的研究中，涉及miRNAs報道或相關研究極少。?

發明人通過microRNA芯片（Agilent?human?8*15k?miRNA?V12.0）檢測了多名喉鱗癌患者及同患者癌旁正常黏膜切緣蠟包埋組織中差異表達的microRNA分子，發現Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌組織中比癌旁正常黏膜組織中下調了約2.74倍，這說明Hsa-miR-145-5p可能在喉鱗癌中充當抑癌基因的角色，發明人進一步通過生物信息學預測及雙熒光報告載體系統，結合喉鱗癌侵襲轉移的特點，描錠并驗證了FSCN1是Hsa-miR-145-5p直接調控靶基因。?

發明目的

本發明的目的是提供一種Hsa-miR-145-5p試劑盒及其成熟體模擬物的應用。

本發明是以Hsa-miR-145-5p的前體序列hsa-mir-145?MI0000461為SEQ?ID?No:1：CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU，為基礎進行的發明。?

本發明提供了一種Hsa-miR-145-5p試劑盒，是由以下組合試劑構成的：?

Hsa-miR-145-5p?基因定量檢測組分：包括Hsa-miR-145-5p?PCR引物，10mM濃度的dNTP，RNase抑制劑，microRNA/cDNA逆轉錄引物，5倍濃度的buffer液，M-MLV，2倍濃度的SYBR?Green?PCR?Master?Mix混合液及去離子水；

Hsa-miR-145-5p熒光原位雜交探針：為與Hsa-miR-145-5p堿基互補的堿基序列，并采用DNA骨架修飾，同時用熒光基團cy3修飾；

FSCN1免疫組化組分：包括鼠抗人FSCN1單克隆抗體，鑲嵌過氧化物酶基團的羊抗鼠二抗，山羊非免疫血清，100倍濃度的PBS及1‰?吐溫20混合液，DAB顯色色原、底物及緩沖液。

上述的試劑盒在喉鱗癌預后評估中的應用，優選地針對喉鱗癌石蠟包埋樣本。?