[發明專利]一種創建甘藍型油菜突變體的方法

無效

• 申請號: 201310408329.7
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN103461102A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 趙志剛;富貴;徐亮;星曉蓉;唐國永;杜德志
• 申請（專利權）人: 青海省農林科學院
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H4/00;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及生物育種技術領域，具體是指一種創建甘藍型油菜突變體的方法。

背景技術

甘藍型油菜是世界上最重要的油料作物之一，也是十字花科植物遺傳研究的典型材料。誘變可以產生豐富的突變體，現已廣泛應用于植物遺傳育種和生物學研究。誘變技術也較早地應用在油菜育種中，空間搭載通過輻射、化學誘變、空間搭載等方法，已經獲得了生育期、長角果長、豐產、高油、花形態、抗除草劑、抗病、葉片黃化等不同類型的變異種質資源,豐富了基因庫,并應用于品種選育之中。但至今尚未發現直接利用白菜型油菜和甘藍種間雜交創建甘藍型油菜新變異的報道。

現有的誘變技術方案主要包括3種類型，分別是物理輻射誘變、化學誘變和航空誘變。物理輻射誘變、化學誘變和航空誘變技術現被廣泛應用于農作物育種，使用誘變技術能使作物產生有益變異，從而獲得與育種目標相符的性狀，據FAO/IAEA(加06)的突變品種數據庫(MVD)統計，目前在線登記突變品種2541個，其中油料作物63個，油菜占25個，突變品種的問世和突變基因的擴散促進了各國的農業生產和經濟發展。

輻射誘變和化學誘變雖然能夠創建突變體，但是所用的物理射線和化學誘變劑對環境以及人體會造成較嚴重的損傷，在使用中對實驗條件和操作技術要求非常嚴格，普通實驗室很難具備理化誘變條件，一般的實驗人員也不具備理化誘變技術，因此，這一技術在普及上有難度。同樣，空間搭載存在著成本高、門檻高等難題，導致一般實驗室也很難應用。

發明內容

本發明的的目的就是為了解決上述現有技術中的不足之處，提供一種新型創建甘藍型油菜突變體的方法。

本發明所述一種新型創建甘藍型油菜突變體的方法，其方法包括如下步驟：

（1）有性雜交

以白菜型油菜和甘藍為父母本，分別進行正反交，于每蕾開花前1-3天進行剝蕾去雄，去雄后立即授粉一次，次日重復授粉一次；

（2）幼胚搶救

授粉10天后，每天剝開角果在體式顯微鏡下觀察胚珠發育狀態和幼胚發育進程，找準幼胚凋亡臨界期，于幼胚凋亡前2-3天取回角果用84消毒液滅菌15分鐘，再用無菌水清洗三次后將角果放于無菌濾紙上剝出幼胚種于固體培養基，培養基成分為MS基本培養基+1.2mg/L6-BA+0.25mg/LNAA；

（3）快繁繼代

在MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA培養基進行快繁，將一顆雜種苗增殖為3個以上的拷貝，為了防止長期連續培養導致雜種苗玻璃化和老化，進行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA兩種培養基交替培養繼代；

（4）染色體加倍

幼嫩的小苗轉入添加有100mg/L秋水仙素的MS培養基中培養12天左右，具體時間視苗子的長勢而定，一般來說當幼苗的頂端明顯變粗時即可停止處理，將處理的幼苗連同愈傷組織一同轉入新鮮的快繁培養基中直到從愈傷組織中分化出新苗；

（5）變異篩選

從創建的異源四倍體（新型的甘藍型油菜AACC）第一代開始，觀察并記錄葉型、葉色、株高、株型、花色、花瓣大小、角果長度、籽粒大小、初花期、終花期、成熟期、花粉育性、自交親和性等性狀不同世代變異情況，同時利用AFLP分子標記檢測新型甘藍型油菜基因組水平變異情況，分子水平檢測到的變異一方面可以與形態上可見變異相互印證，另一方面可以通過分子檢測發現更多的中性突變；AFLP分子標記按照Saghai-Maroof等的CTAB法提取樣品DNA，參照Vos等報道的方法進行AFLP分析,首先利用5U?EcoR?I和2U?Mse?I限制性內切酶(反應體積為25μL)在37℃水浴酶切DNA,酶切片段兩端連接人工接頭E-F:5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'、E-R:5'-AATTGGT

ACGCAGTC-3'、M-F:5'-GACGATGA?GTCCTG?AG-3'和M-R:5'-TACTCAGGACTC

ATC-3'，用預擴增引物擴增連接產物,將預擴產物稀釋后利用選擇性擴增引物進行擴增，選擴產物變性,聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染顯影,篩選出新型甘藍油菜。