[發明專利]一種創建甘藍型油菜突變體的方法

無效

• 申請號: 201310408329.7
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN103461102A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 趙志剛;富貴;徐亮;星曉蓉;唐國永;杜德志
• 申請（專利權）人: 青海省農林科學院
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H4/00;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種創建甘藍型油菜突變體的方法，其特征在于包括如下步驟：

a.有性雜交

以白菜型油菜和甘藍為父母本，分別進行正反交，于每蕾開花前1-3天進行剝蕾去雄，去雄后授粉一次，次日重復授粉一次；

b.幼胚搶救

授粉10天后，每天剝開角果在體式顯微鏡下觀察胚珠發育狀態和幼胚發育進程，找準幼胚凋亡臨界期；在幼胚凋亡前2-3天取回角果用84消毒液滅菌15分鐘，再用無菌水清洗三次后將角果放于無菌濾紙上剝出幼胚種于固體培養基，所述的固體培養基為成分為MS基本培養基+1.2mg/L6-BA+0.25mg/LNAA；

c.快繁繼代

在上述步驟a中的固體培養基中進行快繁，將一顆雜種苗增殖為3個以上的拷貝，進行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA兩種培養基交替培養繼代；

d.染色體加倍

將小苗轉入添加有100mg/L秋水仙素的MS培養基中培養，當幼苗的頂端明顯變粗時停止處理，將處理的幼苗連同愈傷組織一同轉入新鮮的快繁培養基中直到從愈傷組織中分化出新苗；

e.變異篩選

從創建的異源四倍體新型的甘藍型油菜第一代開始，對其植株形態、花色、花瓣大小、籽粒大小、生育期觀察，找出變異植株；用AFLP分子標記檢測新型甘藍型油菜基因組水平變異情況；利用5U?EcoR?I和2U?Mse?I限制性內切酶在37℃水浴酶切DNA，酶切片段兩端連接人工接頭E-F:5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'、E-R:5'-AATTGGTACGCAGTC-3'和M-F:5'-GACGATGA?GTCCTG?AG-3'、M-R:5'-TACTCAGGACTCATC-3'，用預擴增引物擴增連接產物，將預擴產物稀釋后利用選擇性擴增引物進行擴增，篩選出新型甘藍油菜突變體。