[發明專利]一種檢測土壤谷氨酸脫氫酶活性的分析方法

在審

• 申請號: 201310408057.0
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN104422666A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 張麗莉;楊立杰;武志杰
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/33
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 劉陽

1.一種檢測土壤中谷氨酸脫氫酶活性的分析方法，其特征在于：

1）稱取過2-4mm篩的土壤風干樣品使用氯仿進行熏蒸；

2）稱取熏蒸后的土壤每份1克于n（n≥6）支硼硅酸鹽試管中，向試管中加入2.2-2.8ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH7.6）振蕩50-70分，將酶提取到此溶液中；

3）提取后樣品在13000-16000轉/分條件下離心1-3分鐘；

4）離心后將每一個試管的上清液加入到2個丙烯酸比色皿中，每個取0.5-0.9ml；

5）向其中一個比色皿中加入0.08-0.12ml?NH₄⁺溶液（100mM），0.08-0.12ml酮戊二酸溶液（60mM）和0.08-0.12ml?NADPH溶液（1.5mM）；

6）另外一個比色皿作為對照，酮戊二酸用等體積的三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替；

7）比色皿蓋上蓋子，混勻，置于室溫條件下，在340nm條件下比色，3小時內比色3次，每小時1次，分別得到吸光度值A1,A2和A3；

8）根據得到的吸光度值和標準曲線的斜率b計算出對應的NADPH濃度，設定濃度為S，S=A*b；

9）計算出NADPH濃度在單位時間內的減少量，設定減少量為S_d，S_d=[(S1-S2)+(S2-S3)]/2；

10）谷氨酸脫氫酶活性用單位時間NADPH濃度的減少量來表示，單位μmol?NADPH?kg^-1干土h^-1)。

2.按權利要求1所述分析方法，其特征在于：

標準曲線的制作：溶解1molNADPH于100ml三羥甲基氨基甲烷中得溶液A，分別吸取1,2,3,4,5ml溶液A用100ml三羥甲基氨基甲烷溶液溶解，得到濃度為10，20，30，40和50μmol/ml的B1～B5溶液，將B1～B5溶液在340nm條件下比色，根據得到的吸光度和樣品濃度繪制標準曲線，得到斜率b。