[發(fā)明專利]一種檢測土壤谷氨酸脫氫酶活性的分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310408057.0
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN104422666A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張麗莉;楊立杰;武志杰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/33
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 劉陽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及土壤中谷氨酸脫氫酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中谷氨酸脫氫酶活性的分析方法。

背景技術(shù)

土壤中的谷氨酸脫氫酶催化酮戊二酸生成谷氨酸鹽的反應(yīng)：

氮是土壤中微生物生長繁殖所需最重要的營養(yǎng)元素，細(xì)菌和真菌可利用很多種有機和無機氮化合物。微生物對有機氮和無機氮的利用比例強烈影響氮在土壤中的循環(huán)以及微生物和植物對氮的競爭。NH₄⁺是土壤中能夠被直接利用的無機氮形態(tài)，微生物對無機氮的利用有兩種機制，結(jié)果都是通過胺化作用將α-酮戊二酸合成谷氨酸鹽。其中一種途徑由谷氨酸脫氫酶（E.C.1.4.13）進行催化。谷氨酸脫氫酶對NH₄⁺的俘獲能力較弱，親合力較小（較大的Km值），因此只有在NH₄⁺濃度較高時這種酶的有效性才能顯現(xiàn)出來，但當(dāng)土壤中微生物活動需要的C源不足時，此種酶的優(yōu)勢就顯現(xiàn)出來，因為這種酶發(fā)揮作用不需要ATP。對這種酶活性的測定有助于理解微生物對無機氮不同利用途徑的強弱，對探究土壤氮的形為具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢驗土壤中谷氨酸脫氫酶活性的分析方法。該方法是首次對土壤谷氨酸脫氫酶活性的測定，通過對不同土壤樣品的測定表明，分析結(jié)果精確可靠，分析重現(xiàn)性較好。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種檢測土壤中谷氨酸脫氫酶活性的分析方法：

1）稱取過2-4mm篩的土壤風(fēng)干樣品使用氯仿進行熏蒸；

2）稱取熏蒸后的土壤每份1克于n（n≥6）支硼硅酸鹽試管中，向試管中加入2.2-2.8ml三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH7.6）振蕩50-70分，將酶提取到此溶液中；

3）提取后樣品在13000-16000轉(zhuǎn)/分條件下離心1-3分鐘；

4）離心后將每一個試管的上清液加入到2個丙烯酸比色皿中，每個取0.5-0.9ml；

5）向其中一個比色皿中加入0.08-0.12ml?NH₄⁺溶液（100mM），0.08-0.12ml酮戊二酸溶液（60mM）和0.08-0.12ml?NADPH溶液（1.5mM）；

6）另外一個比色皿作為對照，酮戊二酸用等體積的三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替；

7）比色皿蓋上蓋子，混勻，置于室溫條件下，在340nm條件下比色，3小時內(nèi)比色3次，每小時1次，分別得到吸光度值A(chǔ)1,A2和A3；

8）根據(jù)得到的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率b計算出對應(yīng)的NADPH濃度，設(shè)定濃度為S，S=A*b；

9）計算出NADPH濃度在單位時間內(nèi)的減少量，設(shè)定減少量為S_d，S_d=[(S1-S2)+(S2-S3)]/2；

10）谷氨酸脫氫酶活性用單位時間NADPH濃度的減少量來表示，單位μmol?NADPH?kg^-1干土h^-1)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：溶解1molNADPH于100ml三羥甲基氨基甲烷中得溶液A，分別吸取1,2,3,4,5ml溶液A用100ml三羥甲基氨基甲烷溶液溶解，得到濃度為10，20，30，40和50μmol/ml的B1～B5溶液，將B1～B5溶液在340nm條件下比色，根據(jù)得到的吸光度和樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率b。

本發(fā)明方法的測定原理

在土壤中，谷氨酸脫氫酶在發(fā)揮上述作用的同時需要消耗NADPH作為電子受體，在反應(yīng)過程中被氧化，NADPH可以在340nm條件下通過分光光度計檢測。通過測定單位時間內(nèi)NADPH濃度的變化來表示谷氨酸脫氫酶的活性。

具體實施方式

1.試劑配制：

1)三羥基氨基甲烷緩沖液（pH7.6）：溶解12.12g?l^-1三羥基氨基甲烷于水中；

2)60mM酮戊二酸溶液：溶解10.09gα-酮戊二酸于100ml緩沖液中；

3)100mM(NH₄)₂Cl溶液：溶解0.89g氯化銨于1l^-1緩沖液中；

4)1.5mM?NADPH溶液：溶解1.25gβ-NADPH?l^-1緩沖溶液。