[發明專利]hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫

在審

• 申請號: 201310407588.8
• 申請日: 2013-09-01
• 公開（公告）號: CN104419679A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 翁炳煥;陳玉蘭;呂時銘;張琳;徐向榮;張燕
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
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技術領域

本發明涉及hTERT(端粒酶逆轉錄酶催化亞基)和SV40LT(猴腎病毒40大T抗原基因)基因誘導(SV40LT和hTERT介導)構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫，主要用于人類生殖健康研究領域，為克氏綜合征的體外研究提供細胞模型并保存其科研資源。

背景技術

克氏綜合征是染色體出生缺陷之一，又稱為原發性小睪丸癥或曲細精管發育不良，是一種較為常見的男性性染色體異常疾病。本病的特點是染色體數目異常，多了一條X染色體。最常見的核型為47，XXY。有的患者具有兩個以上的X，稱為Klinefelter的變異型，如：48，XXXY、49，xXXXY，一般X越多，臨床癥狀越嚴重。本病的發病率為0.1％。青春期前，一般無明顯癥狀。青春期癥狀逐漸明顯，外陰發育差，陰莖短小，睪丸小而硬，男性第二性發育延遲甚至不發育，皮膚細白，全身體毛發育差，陰毛、胡須稀少而腋毛經常缺如，喉結不明顯，身才高，下體長于上體，近半數患者乳房發育呈女性型乳房。患者性欲低下，性功能不良，除個別患者外幾乎均為無精癥而不能生育。因性功能不良及不能生育等原因，且一般治療無效，這種患者的出生，必給患者本人及家庭造成嚴重的心理負擔和精神痛苦。

克氏綜合征主要因為在精卵授精結合時，染色體不分離造成的。有文獻報道，造成染色體不分離的原因與物理、化學、生物、遺傳等因素有關。但是，由于沒有可在體外長期培養的、可用于克氏綜合征發病機制研究的永生細胞模型及其細胞庫，就難以從細胞水平在體外研究克氏綜合征受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制，從而嚴重限制了克氏綜合征的進一步研究。

國外文獻報道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發生永生化。Poulin?DL、Kung?AL和Sullivan?CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可以用于轉基因動物模型及人類和動物某些種類的細胞模型的建立，據此可以借助于研究轉基因永生化細胞及動物模型而在體外研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制。

但國外最近有研究發現，SV40Tag轉染的細胞伴隨著DNA損傷修復機制的丟失、核型的不穩定性以及少數細胞致瘤性轉化。此外，長期體外培養發現部分轉染SV40Tag的細胞只是延長了壽命，或僅僅渡過了衰老期(MI期)，多數細胞會最終進入危機期(M2期)而死亡，說明細胞并未獲得永生化。同時SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發生、發展有關，因此SV40Tag轉染的細胞對某些研究也存在一定程度的限制性。

國外研究表明，導入外源性hTERT可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對“正常”的生長特征。可以用于人類和動物某些種類的細胞模型的建立，對借助于研究轉基因永生化細胞模型而研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制，具有重要的意義。在口腔醫學領域，日本學者Kamata、Fujita和Fujii轉染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數達150次以上，細胞均表現原有的生物學特性，誘導培養后都可以表達來源細胞的相關蛋白。Kitagawa等轉染hTERT建立了人成牙骨質細胞系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉基因細胞模型、絕經期綜合癥細胞模型、子宮內膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型。等等。