[發明專利]hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫

在審

• 申請號: 201310407588.8
• 申請日: 2013-09-01
• 公開（公告）號: CN104419679A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 翁炳煥;陳玉蘭;呂時銘;張琳;徐向榮;張燕
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于醫學領域的hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫的方法，其主要特征是以T4DNA連接經BamHI酶切質粒SV40LTag?DNA及載體pcDNA3.1(-)DNA的產物，構建SV40LT-pcDNA3.1(-)重組子；并以Ligation?Mix連接經EcoR?I和Xho?I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經感受態細胞擴增純化和鑒定后以脂質體轉染導入克氏綜合征組織細胞，經G418篩選含陽性重組子的細胞克隆并擴大培養，篩選細胞形態、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT?mRNA表達產物、免疫組織化學染色、細胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT介導克氏綜合征體外研究細胞模型凍存于液氮中，為從細胞水平(替代人體或動物直接試驗)在體外長期研究其發病機制奠定基礎。

2.根據權利要求1所述的hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是所指細胞模型為(1)細胞在倒置光學顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；(2)細胞的生長曲線如以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸，在hepato?ZYME-SFM無血清培養基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為“47，XXY”，或相同于本發明采集的原代克氏綜合征細胞核型；(4)細胞不能在軟瓊脂內生長(形成克隆)；(5)細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)細胞的DNA中整合了SV40LT和hTERT基因，同時表達SV40LT和hTERTmRNA產物；(7)細胞傳代至第138代、培養至第8天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達95％以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變稀疏；(8)能反復凍溶、傳代培養138代以上；(9)作為細胞模型用于體外從細胞水平研究克氏綜合征的病理機制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同時整合的克氏綜合征的遺傳資源；(11)用于實驗對照及質控細胞。

3.根據權利要求1所述的hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后多余、廢棄的克氏綜合征患兒羊水脫落細胞構建之。

4.根據權利要求1所述的hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是所用的培養液為含有20％胎牛血清、5～10nmol／L胰島素的RPMI1640或含有20mL／L胎牛血清、5～10nmol／L胰島素的低糖DMEM培養液。

5.根據權利要求1所述的hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是用作傳代培養以備脂質體轉染法導入重組子的克氏綜合征組織細胞，在原代擴增培養中，其收集指標是細胞貼壁培養約3～4天、細胞形態為梭形、小園形細胞不到10％、貼壁細胞的匯合率達75％～85％、處于剛進入對數生長期時收集細胞；用作脂質體轉染法導入重組子的傳代克氏綜合征組織細胞，其時機選擇的指標是細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10％小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55％～65％、處于將進入或剛進入對數生長期時的培養細胞；傳代細胞系收集的指標是選擇細胞貼壁生長的匯合率達80～85％、處于對數生長期的前期時收集細胞；染色體核型分析的細胞收集指標是細胞生長密度達85-95％、小園形細胞占10％以上、處于對數生長期的細胞。

6.根據權利要求1所述的hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是以0.01％膠原酶II消化貼壁生長的克氏綜合征組織細胞，作染色體核型分析時，每5mL培養液中加入250ug／ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養箱4小時。

7.根據權利要求1所述的hTERT和SV40LT基因誘導構建克氏綜合征細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是細胞庫的構建包括(1)篩選經鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的SV40LT和hTERT介導的克氏綜合征細胞；(2)作傳代、擴大培養，取生長狀態良好、處于對數生長期的不同世代的貼壁細胞；(3)經消化、終止、離心(1200r／min，6min)步驟收獲細胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5×10⁵個／ml的細胞懸液；(5)按照4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜；入-196℃液氮的程序凍存細胞；(6)可再生性地長期保存SV40LT和hTERT介導克氏綜合征細胞模型，備作遺傳資源和科研材料。