[發(fā)明專利]hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310407554.9
• 申請(qǐng)日: 2013-09-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104419728A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翁炳煥;朱依敏;沈國(guó)松;金帆;毛愉嬋;楊燕梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 翁炳煥
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及hTERT(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)及SV40LT(猴腎病毒40大T抗原基因)聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，主要用于生殖健康研究領(lǐng)域，為染色體缺失貓叫綜合征的體外研究提供細(xì)胞模型并保存其科研資源。

背景技術(shù)

染色體缺失貓叫綜合征又稱cri—du—chat綜合征，是1963年法國(guó)科學(xué)家首先報(bào)告的一種特殊疾病。小兒貓叫綜合征是5號(hào)染色體短臂缺失所引起的，而且多數(shù)缺失是兩次斷裂的結(jié)果，從理論上染色體部分缺失的原因至少有4種：末端缺失、中間缺失、易位和短臂內(nèi)的不等互換，有人發(fā)現(xiàn)缺失部分均有5p14，因此5p14被認(rèn)為是貓叫綜合征的特征區(qū)。從染色體的變化來(lái)看，第5號(hào)染色體的短臂上有發(fā)音的遺傳基因，當(dāng)此處缺失時(shí)，可發(fā)生發(fā)音音調(diào)的變異。

貓叫綜合征的臨床表現(xiàn)是病兒出生時(shí)平均體重低于2500g，身長(zhǎng)低于正常兒，平均頭圍31cm。生長(zhǎng)障礙，最顯著的特征為嬰兒期有微弱的、悲哀的、咪咪似貓叫的哭聲，此種哭聲在呼氣時(shí)發(fā)生，吸氣時(shí)不出現(xiàn)。典型哭聲常在幼兒早期逐漸消失，但有些年齡較大兒童及成人患者仍有獨(dú)特的哭聲。患兒顱面部發(fā)育不良，頭小而圓，滿月臉。兩眼距離過(guò)寬及小下頜均很明顯，瞼裂輕度斜向外下，有內(nèi)眥贅皮，斜視，白內(nèi)障。鼻梁寬而平。小耳，稍低位，有時(shí)耳道窄。隨年齡變化，小頭持續(xù)存在，但臉變長(zhǎng)，下頜骨發(fā)育不良更為明顯。齲齒，腭弓高。1／3病例可有先天性心血管畸形。腎及各種骨骼畸形(如脊柱側(cè)彎，并指、趾和肋骨畸形等)亦可見(jiàn)。四肢肌張力低，隨年齡增長(zhǎng)肌張力增高，反射增強(qiáng)。發(fā)育明顯落后，2歲時(shí)才會(huì)坐，4歲時(shí)才會(huì)走，出現(xiàn)一種痙攣性步態(tài)。有些病兒似嬰兒樣臥床不起，不會(huì)說(shuō)話或只能簡(jiǎn)單說(shuō)幾個(gè)字，智能低下，智商多低于20。據(jù)國(guó)外報(bào)道，貓叫綜合征的12％源自雙親之一的染色體平衡易位，因此可對(duì)患兒的雙親進(jìn)行染色體檢查，以預(yù)測(cè)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、減少或者杜絕患兒出生。其他發(fā)病原因還有待于進(jìn)一步的研究。

但是，由于沒(méi)有理想的可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的、可用于發(fā)病機(jī)制研究的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，就難以從細(xì)胞水平在體外研究染色體缺失貓叫綜合征細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制，從而嚴(yán)重限制了染色體缺失貓叫綜合征的進(jìn)一步研究。

國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin?DL、Kung?AL和Sullivan?CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞及動(dòng)物模型而在體外研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制。

但國(guó)外最近有研究發(fā)現(xiàn)，SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞伴隨著DNA損傷修復(fù)機(jī)制的丟失、核型的不穩(wěn)定性以及少數(shù)細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化。此外，長(zhǎng)期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)染SV40Tag的細(xì)胞只是延長(zhǎng)了壽命，或僅僅渡過(guò)了衰老期(MI期)，多數(shù)細(xì)胞會(huì)最終進(jìn)入危機(jī)期(M2期)而死亡，說(shuō)明細(xì)胞并未獲得永生化。同時(shí)SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因此SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)某些研究也存在一定程度的限制性。

國(guó)外研究表明，導(dǎo)入外源性hTERT可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征。近年來(lái)已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無(wú)致瘤性等相對(duì)“正常”的生長(zhǎng)特征。可以用于人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，對(duì)借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞模型而研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制，具有重要的意義。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來(lái)源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細(xì)胞模型。如糖尿病細(xì)胞模型、癌細(xì)胞細(xì)胞模型、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細(xì)胞模型、子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型、癲癇細(xì)胞模型、電子細(xì)胞模型、酒精性癡呆細(xì)胞模型、腦水腫細(xì)胞模型。等等。