[發(fā)明專利]hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310407554.9
• 申請(qǐng)日: 2013-09-01
• 公開（公告）號(hào): CN104419728A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翁炳煥;朱依敏;沈國松;金帆;毛愉嬋;楊燕梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 翁炳煥
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的方法，其主要特征是以T4DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag?DNA及載體pcDNA3.1(-)DNA的產(chǎn)物，構(gòu)建SV40LT—pcDNA3.1(-)重組子；并以Ligation?Mix連接經(jīng)EcoR?I和Xho?I雙酶切質(zhì)粒pCIneo—hTERT和載體pLXSNneo的產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo—hTERT重組子，兩重組子經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增純化和鑒定后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入染色體缺失貓叫綜合征組織細(xì)胞，經(jīng)G418篩選含陽性重組子的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT?mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT聯(lián)合介導(dǎo)染色體缺失貓叫綜合征體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平(替代人體或動(dòng)物直接試驗(yàn))在體外長期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的方法，其特征是所指細(xì)胞模型為(1)細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長；(2)細(xì)胞的生長曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepato?ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為“46，XX(XY)，5P^-”，即染色體數(shù)目為46條(二倍體)，并具有5號(hào)染色體短臂缺失；(4)細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(形成克隆)；(5)細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；(6)細(xì)胞的DNA中同時(shí)整合了SV40LT和hTERT基因，同時(shí)表達(dá)SV40LT和hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；(7)細(xì)胞傳代至第175代、培養(yǎng)至第12天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達(dá)86％以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變稀疏。(8)作為細(xì)胞模型用于在體外從細(xì)胞水平研究染色體缺失貓叫綜合征的發(fā)病機(jī)制、遺傳資源貯存、實(shí)驗(yàn)對(duì)照及質(zhì)控細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的方法，其特征是取自因其他實(shí)驗(yàn)所需而采集的、并在其他實(shí)驗(yàn)后多余、廢棄的染色體缺失貓叫綜合征患兒的羊水脫落細(xì)胞構(gòu)建之。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的方法，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20％胎牛血清、5～10nmol／L胰島素的RPMI1640或含有20mL／L胎牛血清、5～10nmol／L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的方法，其特征是用作傳代培養(yǎng)以備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的染色體缺失貓叫綜合征組織細(xì)胞，在原代擴(kuò)增培養(yǎng)中，其收集指標(biāo)是細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3～4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10％、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)75％～85％、處于剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)收集細(xì)胞；用作脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的傳代染色體缺失貓叫綜合征組織細(xì)胞，其時(shí)機(jī)選擇的指標(biāo)是細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10％小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)55％～65％、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)的培養(yǎng)細(xì)胞；傳代細(xì)胞系收集的指標(biāo)是選擇細(xì)胞貼壁生長的匯合率達(dá)80～85％、處于對(duì)數(shù)生長期的前期時(shí)收集細(xì)胞；染色體核型分析的細(xì)胞收集指標(biāo)是細(xì)胞生長密度達(dá)85—95％、小園形細(xì)胞占10％以上、處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的方法，其特征是以0.01％膠原酶II消化貼壁生長的組織細(xì)胞，作染色體核型分析時(shí)，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug／ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hTERT及SV40LT聯(lián)合介導(dǎo)構(gòu)建貓叫綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的方法，其特征是細(xì)胞庫的構(gòu)建包括(1)篩選經(jīng)鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的SV40LT和hTERT聯(lián)合介導(dǎo)的染色體缺失貓叫綜合征；(2)作傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的不同世代的貼壁細(xì)胞；(3)經(jīng)消化、終止、離心(1200r／min，6min)步驟收獲細(xì)胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5×10⁵個(gè)／ml的細(xì)胞懸液；(5)按照4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜；入-196℃液氮的程序凍存細(xì)胞；(6)可再生性地長期保存SV40LT和hTERT聯(lián)合介導(dǎo)染色體缺失貓叫綜合征細(xì)胞模型，備作遺傳資源和科研材料。