[發明專利]hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫

在審

• 申請號: 201310407540.7
• 申請日: 2013-09-01
• 公開（公告）號: CN104419674A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 翁炳煥;徐向榮;李曉;孫義錫;羅玉琴;金帆
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
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技術領域

本發明涉及hTERT(端粒酶逆轉錄酶催化亞基)誘導(介導)構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫，主要用于新生兒出生缺陷干預研究領域，為先天性心臟病房間隔缺損的體外研究提供細胞模型并保存其科研資源。

背景技術

先天性心臟病房間隔缺損是發病率最高的出生缺陷之一，已成為嚴重的社會問題。我國每年新發先天性心臟病11.2萬-16.0萬例，將造成經濟損失109億-156億；先天性心臟病的治療費每年高達120億元，給社會和家庭造成了嚴重的心理負擔和精神痛苦，已嚴重影響我國的人口質量，已成為社會發展的沉重負擔和可持續發展的嚴重障礙。

先天性心臟病等出生缺陷的研究及干預已成為我國政府行為，黨中央《決定》自2006年開始實施“出生缺陷干預工程”；中華人民共和國主席令《1994年10月27日第三十三號》公布我國自1995年6月1日起施行(出生缺陷)產前診斷的有關法規標準；全國人民代表大會相繼頒布了《中華人民共和國母嬰保健法》、《中華人民共和國母嬰保健法實施辦法》等一系列法規，促進了出生缺陷產前診斷、干預工作的開展；在《國民經濟和社會發展的第十一個五年規劃綱要》中強調加大出生缺陷干預力度，改善出生人口素質；在《國家中長期科學和技術發展規劃綱要(2006-2020年)》中將出生缺陷的研究列為優先主題。

目前認為先天性心臟病房間隔缺損是遺傳和環境因素等復雜關系相互作用的結果，主要包括①.胎兒發育的環境因素：如妊娠前三個月患病毒或細菌感染尤其是風疹病毒，其次是柯薩奇病毒，其出生的嬰兒先天性心臟病的發病率較高。其它如羊膜的病變，胎兒受壓，妊娠早期先兆流產，母體營養不良、糖尿病、苯酮尿、高血鈣，放射線和細胞毒性藥物在妊娠早期的應用，母親年齡過大等均有使胎兒發生先天性心臟病的可能。②遺傳因素：多數的先天性心臟病是由多個基因與環境因素相互作用所形成。③其他因素：與地區、性別也有關系。

近年來，對先天性心臟病等出生缺陷的研究主要是針對遺傳、生物、物理、化學因素與發病(率)的關系進行流行病學方面的調查研究。但是，由于沒有可在體外長期培養的、可用于先天性心臟病發病機制研究的永生細胞模型及其細胞庫，就難以從細胞水平在體外研究先天性心臟病房間隔缺損細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制，從而嚴重限制了先天性心臟病房間隔缺損的進一步研究。

國外文獻報道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發生永生化。Poulin?DL、Kung?AL和Sullivan?CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可以用于轉基因動物模型及人類和動物某些種類的細胞模型的建立，據此可以借助于研究轉基因永生化細胞及動物模型而在體外研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制。

但最近有研究發現，SV40Tag轉染的細胞伴隨著DNA損傷修復機制的丟失、核型的不穩定性以及少數細胞致瘤性轉化。此外，長期體外培養發現部分轉染SV40Tag的細胞只是延長了壽命，或僅僅渡過了衰老期(MI期)，多數細胞會最終進入危機期(M2期)而死亡，說明細胞并未獲得永生化。同時SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發生、發展有關，因此SV40Tag轉染的細胞對某些研究也存在一定程度的限制性。

國外研究表明，導入外源性hTERT可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對“正?！钡纳L特征?？梢杂糜谌祟惡蛣游锬承┓N類的細胞模型的建立，對借助于研究轉基因永生化細胞模型而研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制，具有重要的意義。