[發明專利]hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫

在審

• 申請號: 201310407540.7
• 申請日: 2013-09-01
• 公開（公告）號: CN104419674A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 翁炳煥;徐向榮;李曉;孫義錫;羅玉琴;金帆
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于醫學領域的hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其主要特征是以內切酶EcoR?I和Xho?I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligation?Mix連接經PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態細胞以純化擴增并抽提質粒，以脂質體轉染離體傳代呈對數生長的先天性心臟病房間隔缺損細胞，使重組子與細胞DNA整合，并擴大培養經G418篩選含陽性重組子克隆，篩選細胞形態、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、細胞端粒酶活性、hTERT?mRNA表達、免疫組化、細胞增殖周期及其凋亡率符合永生細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT介導先天性心臟病房間隔缺損體外研究細胞模型凍存于液氮，為從細胞水平(替代人體或動物直接試驗)在體外長期研究其發病機制奠定基礎。

2.根據權利要求1所述的hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是所指細胞模型為(1)細胞在倒置光學顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；(2)細胞的生長曲線如以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸，在hepato?ZYME—SFM無血清培養基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)細胞染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發明采集的原代細胞；(4)細胞不能在軟瓊脂內生長(形成克隆)；(5)細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)細胞的DNA中整合了hTERT基因，表達hTERT基因的mRNA產物；(7)細胞傳代至第95代、培養至第9天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達82％以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變稀疏；(8)用于集中保存hTERT轉染的可再生的先天性心臟病房間隔缺損細胞的遺傳資源并用于在體外從細胞水平研究環境因素致先天性心臟病房間隔缺損的發病機制、研究對環境有害物的耐受性。

3.根據權利要求1所述的hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后多余、廢棄的先天性心臟病房間隔缺損患兒羊水脫落細胞構建之。

4.根據權利要求1所述的hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是所用的培養液為含有20％胎牛血清、5～10nmol／L胰島素的RPMI1640或含有20mL／L胎牛血清、5～10nmol／L胰島素的低糖DMEM培養液。

5.根據權利要求1所述的hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是用作傳代培養以備脂質體轉染法導入重組子的先天性心臟病房間隔缺損組織細胞，在原代擴增培養中，其收集指標是細胞貼壁培養約3～4天、細胞形態為梭形、小園形細胞不到10％、貼壁細胞的匯合率達75％～85％、處于剛進入對數生長期時收集細胞；用作脂質體轉染法導入重組子的傳代先天性心臟病房間隔缺損組織細胞，其時機選擇的指標是細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10％小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55％～65％、處于將進入或剛進入對數生長期時的培養細胞；傳代細胞系收集的指標是選擇細胞貼壁生長的匯合率達80～85％、處于對數生長期的前期時收集細胞；染色體核型分析的細胞收集指標是細胞生長密度達85-95％、小園形細胞占10％以上、處于對數生長期的細胞。

6.根據權利要求1所述的hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是以0.01％膠原酶II消化貼壁生長的先天性心臟病房間隔缺損組織細胞，作染色體核型分析時，每5mL培養液中加入250ug／ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養箱4小時。

7.根據權利要求1所述的hTERT誘導構建先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是細胞庫的構建包括(1)篩選經鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的hTERT誘導的先天性心臟病房間隔缺損細胞；(2)作傳代、擴大培養，取生長狀態良好、處于對數生長期的不同世代的貼壁細胞；(3)經消化、終止、離心(1200r／min，6min)步驟收獲細胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5×10⁵個／ml的細胞懸液；(5)按照4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜；入-196℃液氮的程序凍存細胞；(6)可再生性地長期保存hTERT誘導先天性心臟病房間隔缺損細胞模型，備作遺傳資源和科研材料。