[發明專利]一種檢測土壤谷氨酰胺酶活性的分析方法

有效

• 申請號: 201310407251.7
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN104422690B
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 張麗莉;楊立杰;武志杰
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 劉陽

技術領域

本發明涉及土壤中谷氨酰胺酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法。

背景技術

土壤中的谷氨酰胺酶催化氨與谷氨酸氨生成谷氨酸鹽的反應：

氮是土壤中微生物生長繁殖的最重要的營養元素，細菌和真菌可利用很多種有機和無機氮化合物。微生物對有機氮和無機氮的利用比例強烈影響氮在土壤中的循環以及微生物和植物對氮的競爭。NH₄⁺是土壤中能夠被直接利用的無機氮形態，微生物對無機氮的利用有兩種機制，結果都是通過胺化作用將α-酮戊二酸合成谷氨酸鹽。其中一種途徑由谷氨酰胺合成酶(E.C.6.3.1.2)進行催化.谷氨酰胺合成酶對NH₄⁺的俘獲能力較強，親合力較大(較小的Km值)，因此在NH₄⁺濃度較低時此種酶有效性較強。對這種酶活性的測定有助于理解微生物對無機氮不同利用途徑的強弱，對探究土壤氮的形為具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢驗土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法。該方法是首次對土壤谷氨酰胺酶活性的測定，通過對不同土壤樣品的測定表明，分析結果精確可靠，分析重現性較好。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種檢測土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法，

1)稱取過2-4mm篩的土壤風干樣品使用氯仿進行熏蒸；

2)稱取熏蒸后的土壤每份1克于n(n≥6)個硼硅酸鹽試管中，其中向n/2支加入0.3-0.5ml反應液，另外n/2支加入0.3-0.5ml對照液；

3)向所有試管中加1.5-1.8ml谷氨酰胺溶液(0.2M)。

4)試管在室溫條件下使用往復振蕩器振蕩50-70分鐘；

5)振蕩后加入4.0-4.8ml終止液；

6)靜止3分鐘；待固體顆粒沉淀后，取1.3ml上清液進行離心；

7)取1ml離心后得到的上清液；

8)使用分光光度計在540nm條件下比色；

9)得到吸光度值A；

10)根據吸光度值A和斜率b，計算所測定溶液中的5-N-羥基谷氨酰胺的濃度S，S＝A*b,其中樣品中的濃度定義為S1,對照中的濃度定義為S2；

11)計算土壤谷氨酰胺合成酶活性,單位為mmol羥基谷氨酰胺kg干土h^-1

計算公式為：【(S1–S2)*V/1000】*V/W.T＝mmol羥基谷氨酰胺kg干土h^-1式中：S1為樣品中的羥基谷氨酰胺濃度(mmol/L)，S2為對照中的羥基谷氨酰胺濃度(mmol/L)，V為浸提液總體積(mL)，W為土樣重(g)，1000為單位轉換系數，T土樣培養時間(h)。

制作工作標準曲線過程，1)配制標準溶液：稱取1.621g 5-N-羥基谷胺酰胺溶于1000ml吡唑溶液中，得到濃度為10mmol/L的標準儲備液，2)吸取0，1，2，3，4，5ml標準儲備液加入到比色皿中，再加入4.0ml-4.8ml終止液，而后將所有的樣品補齊到10ml，得到濃度為0，1，2，3，4，5mmol/L的系列濃度溶液，在540nm條件下進行比色，得到的吸光度和樣品濃度繪制標準曲線，得到斜率b。

所述反應液為10.5ml吡唑緩沖液(pH 7.15)；0.9ml鹽酸羥胺(800Mm)；0.1ml MnCL2l﹒4H2O(100mM)；1.4ml KH₂AsO₄(280mM)；0.14ml二磷酸腺苷5’谷氨酸鈉鹽(40mM)；對照液為11.95ml吡唑緩沖液(pH 7.15)；0.9ml鹽酸羥胺；0.1ml MnCL2﹒4H2O；0.14ml二磷酸腺苷5’谷氨酸鈉鹽；終止液為21ml鹽酸，20g三氯甲酸,55g FeCl₃﹒6H₂O溶于1L去離子水中。

本發明方法的測定原理

在土壤中，谷氨酸氨合成酶在發揮上述作用的同時也催化一個轉化反應，它在Mn₂⁺存在時對腺苷酰化作用不敏感，酶活性穩定，易于測定，反應的產物羥基谷氨酰胺與氯化鐵反應生成紅色化學物質，可以在540nm條件下比色測定，基于此轉化反應，測定谷氨酰胺合成酶活性。

具體實施方式

1.試劑配制：