[發(fā)明專利]一種檢測土壤谷氨酰胺酶活性的分析方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310407251.7
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN104422690B
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張麗莉;楊立杰;武志杰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司21002
• 代理人: 劉陽

1.一種檢測土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法，其特征在于：

1)稱取過2-4mm篩的土壤風(fēng)干樣品使用氯仿進行熏蒸；

2)稱取熏蒸后的土壤每份1克于n個硼硅酸鹽試管中，n≥6，其中向n/2支加入0.3-0.5ml反應(yīng)液，另外n/2支加入0.3-0.5ml對照液；

3)向所有試管中加1.5-1.8ml 0.2M的谷氨酰胺溶液。

4)試管在室溫條件下使用往復(fù)振蕩器振蕩50-70分鐘；

5)振蕩后加入4.0-4.8ml終止液；

6)靜止3分鐘；待固體顆粒沉淀后，取1.3ml上清液進行離心；

7)取1ml離心后得到的上清液；

8)使用分光光度計在540nm條件下比色；

9)得到吸光度值A(chǔ)；

10)根據(jù)吸光度值A(chǔ)和斜率b，計算所測定溶液中的5-N-羥基谷氨酰胺的濃度S，S＝A*b,其中樣品中的濃度定義為S1,對照中的濃度定義為S2；

11)計算土壤谷氨酰胺酶活性,單位為mmol·kg^-1·h^-1計算公式為：【(S1–S2)*V/1000】/W·T單位為mmol·kg^-1·h^-1

式中：S1為樣品中的羥基谷氨酰胺濃度，其單位為mmol/L；S2為對照中的羥基谷氨酰胺濃度，其單位為mmol/L；V為浸提液總體積，其單位為mL；W為土樣重，其單位為kg；1000為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；T土樣培養(yǎng)時間，其單位為h；

所述反應(yīng)液為10.5ml吡唑緩沖液，吡唑緩沖液pH為7.15；0.9ml鹽酸羥胺，其中鹽酸羥胺800Mm；0.1ml濃度為100mM MnCL₂l·4H2O；1.4ml濃度280mM KH₂AsO₄；0.14ml濃度為40mM二磷酸腺苷5’谷氨酸鈉鹽；對照液為11.95ml吡唑緩沖液，吡唑緩沖液pH為7.15；0.9ml鹽酸羥胺；0.1ml MnCL2·4H2O；0.14ml二磷酸腺苷5’谷氨酸鈉鹽；終止液為21ml鹽酸，20g三氯甲酸,55g FeCl₃·6H₂O溶于1L去離子水中。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于：制作工作標(biāo)準(zhǔn)曲線過程，1)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取1.621g 5-N-羥基谷胺酰胺溶于1000ml吡唑溶液中，得到濃度為10mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，2)吸取0，1，2，3，4，5ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液加入到比色皿中，再加入4.0ml-4.8ml終止液，而后將所有的樣品補齊到10ml，得到濃度為0，1，2，3，4，5mmol/L的系列濃度溶液，在540nm條件下進行比色，得到的吸光度和樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率b。