[發(fā)明專利]一種甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種檢測的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310405495.1
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN103451298A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊宇紅;張吉祥;凌鍵;陳國華;茆振川;謝丙炎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77
• 代理公司: 北京東正專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11312
• 代理人: 蔡仲德

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測鑒定及植物檢疫的領(lǐng)域，具體是一種甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種的檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)在公知的甘藍枯萎病菌就是尖孢鐮刀菌粘團專化型，尖孢鐮刀菌粘團專化型（Fusarium?oxysporum?f.?sp.?Conglutinans）引起的甘藍枯萎病是一種毀滅性的土傳病害，在全球大部分甘藍產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，該病自2001年在我國首次報道發(fā)生以來，先后在河北省張家口市、山西省晉中市和山西省大同市均有發(fā)生，在我國的發(fā)生呈蔓延趨勢，并逐年加重，已成為影響我國甘藍品質(zhì)和產(chǎn)量的重要病害。根據(jù)危害寄主甘藍的品種，可分為2個生理小種，目前我國甘藍生產(chǎn)主要受到1號生理小種的危害。該病自2001年在我國延慶地區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，發(fā)病面積逐年增加，已成為威脅我國甘藍生產(chǎn)的重要因素。目前生產(chǎn)上缺少有效防控甘藍枯萎病的方法，因此，快速穩(wěn)定的病原菌鑒定與檢測體系是對該病害進行綜合防控的基礎(chǔ)。現(xiàn)有甘藍枯萎病菌生理小種的鑒定與檢測技術(shù)仍然以傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定和鑒別寄主鑒定為主。但是形態(tài)學鑒定需要經(jīng)驗極其豐富的專家操作并且生理小種之間形態(tài)學差異較小，難以得到準確的鑒定結(jié)果。而利用鑒別寄主鑒定生理小種費時費力且需要大量的品種。隨著生命科學的高速發(fā)展，包括AFLP，RFLP，以及SCAR在內(nèi)的分子檢測技術(shù)在病原菌的應(yīng)用得到植物病理學家的重視，基于各生理小種的特異基因設(shè)計特異性引物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于枯萎病菌生理小種的分子檢測。

植物病理學家已基于特異性引物成功建立了快速檢測番茄枯萎病菌（Fusarium?oxysporum?f.?sp.?ciceris），香蕉枯萎病菌（F.?oxysporum?f.?sp.?cubense），萵苣枯萎病菌（Fusarium?oxysporum?f.sp.lactucae），香石竹枯萎病菌（Fusarium?oxysporum?f.?sp.?dianthi），豌豆枯萎病菌（Fusarium?oxysporum?f.sp.pisi）和唐菖蒲枯萎病菌（Fusarium?oxysporum?f.?sp.?gladioli）不同生理小種的分子鑒定體系。利用這一技術(shù)在對香蕉枯萎病進行分子診斷時的靈敏度達到0.2μg?新鮮菌絲的水平。同時該技術(shù)也在種子，土壤以及發(fā)病組織中病原菌的檢測上得到了充分應(yīng)用。三重PCR檢測技術(shù)也在香蕉枯萎病菌1號和4號生理小種鑒定中得到了應(yīng)用。甘藍枯萎病菌生理小種的檢測與鑒定技術(shù)尚未見報道，本研究在甘藍枯萎病菌1，2號生理小種全基因組測序數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，篩選出兩小種各自的特異引物并引入尖孢鐮刀菌通用引物W106R/W106S為內(nèi)標，建立起一步三重PCR快速檢測甘藍枯萎病菌1，2號生理小種的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述檢測甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明公開了一種甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種檢測試劑盒及其檢測方法，其目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種的生物學檢測方法所需周期長，且目前尚未有甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種分子檢測方法的問題，通過對甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種進行全基因組測序，并通過比較基因組學的方法找出甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種的特異基因組片段，然后這針對甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種的特異片段堿基序列分別設(shè)計特異引物，用于帶甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測，并提供一種準確性高、操作簡便、特異性強且靈敏度高的甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種快速分子檢測的試劑盒，該試劑盒可用于帶菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測，對于甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種引起病害顯癥之前的早期檢測和診斷具有十分重要的意義。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，本發(fā)明公開了一種甘藍枯萎病菌的檢測試劑盒，該試劑盒包括，濃度為1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，濃度為10pmol/μl?的甘藍枯萎病菌1號生理小種特異引物1#77R、1#77S各1μl，濃度為10pmol/μl?的甘藍枯萎病菌2號生理小種特異引物2#40R、2#40S各1μl?，10×PCR?Easy?Taq緩沖液2.0μl、10mM?的dNTPs0.5μl、活性酶濃度為5U/ml的?Taq聚合酶0.4μl、甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種陽性對照DNA各1μl、重量濃度≥99%的超純水20ul。檢測引物的序列：

W106R的序列5'-?GCAGTCGTACGTCATCGACC?-3'、