[發明專利]一種甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種檢測的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310405495.1
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN103451298A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 楊宇紅;張吉祥;凌鍵;陳國華;茆振川;謝丙炎
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 蔡仲德

1.一種甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒的試劑包括檢測引物、10×PCR?Easy?Taq緩沖液2.0μl、10mM?的dNTPs0.5μl、活性酶濃度為5U/ml的?Taq聚合酶0.4μl、甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種陽性對照DNA各1μl、重量濃度≥99%的超純水20ul；檢測引物包括濃度為1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，濃度均為10pmol/μl?的甘藍枯萎病菌1號生理小種的上游引物1#77R、下游引物1#77S各1μl，濃度均為10pmol/μl?的甘藍枯萎病菌2號生理小種上游引物2#40R、下游引物2#40S各1μl；1#77R的序列5'-?AAATCCAAGGTGCGAAGA?-3'，1#77S的序列為5'-?CCAGGCTACACTAATACAACAG?-3'，2#40R的序列為5'-?CTTTCGCTTCTCCCTTCA?-3'，2#40S的序列為5'-?AACGCATCGTCTTCTATT?-3'。

2.一種采用權利要求1所述試劑盒檢測甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟，(1)利用NuClean?Plant?Gen?DNA?Kit試劑盒提取被甘藍枯萎病菌1號或2號生理小種感染的植物組織DNA，利用PowerSoil?DNA?Isolation?Kit?試劑盒方法提取被甘藍枯萎病菌侵染的土壤DNA；

（2）采用檢測試劑盒對（1）步分離出的DNA進行PCR擴增；

（3）將6μl步驟（2）的PCR擴增產物用質量濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，分離后再經溴化乙錠染色于紫外燈下根據擴增產物的大小判定結果，當同時擴增出兩條大小分別為729bp和1927bp產物時，可判斷植物組織或土壤中存在甘藍枯萎病菌1號生理小種，當同時擴增出兩條大小分別為729bp和309bp產物時，可判斷植物組織或土壤中存在甘藍枯萎病菌2號生理小種。

3.根據權利要求2所述檢測甘藍枯萎病菌的方法，其特征在于，所述步驟（2）的具體操作方法是，①取（1）步的DNA1μl，將其與試劑盒的試劑混合，該試劑盒的試劑包括濃度為1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，濃度為10pmol/μl?的甘藍枯萎病菌1號生理小種上游引物1#77R、下游引物1#77S各1μl，濃度為10pmol/μl?的甘藍枯萎病菌2號生理小種上游引物2#40R、下游引物2#40S各1μl?，10×PCR?Easy?Taq緩沖液2.0μl、10mM?的dNTPs0.5μl、活性酶濃度為5U/ml的?Taq聚合酶0.4μl、甘藍枯萎病菌1號和2號生理小種陽性對照DNA各1μl、重量濃度≥99%的超純水20ul；?

②將①步的混合物放入PCR儀器中進行擴增，PCR擴增程序為：94?°C?預變性?5?min；94°C變性?40?sec；60°C退火?30?sec；72?°C延伸?1?min?30sec；?35?個循環，最后?72?°C延伸10?min。