[發明專利]火木層孔菌中1,2-苯二酚在抗禽流感H5N1病毒上的應用

有效

• 申請號: 201310404207.0
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN103816138A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 趙晨;宋愛榮;孔超;孫效樂;秦丹
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: A61K31/05
• 分類號: A61K31/05;A61P31/16;C07C39/08;C07C37/82;A01G1/04
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技術領域

本發明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013?年8月26日保藏在北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，分類名稱：火木層孔菌Phellinus?igniarius，保藏編號為CGMCC?No.8108。?

背景技術

???苯二酚能與蒸汽一起揮發，是強還原劑，遇明火能燃燒，受高熱散發出有毒、有腐蝕性氣味，能經皮膚引起中毒，能升華，對中樞神經、呼吸系統有刺激作用，大鼠經口LD50為3890mg/kg，與間苯二酚及對苯二酚不同。?

???苯二酚具有抗菌等多種重要的生理活性，如今，未見到有抗禽流感病毒活性的報到。?

發明內容

本發明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的苯二酚。本發明首次公開了這種苯二酚的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。?

本方法較一般化合物應用的優點在于：發現了該種苯二酚的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。?

本發明的技術方案如下：?

首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是：

玉米淀粉????1-5%?????????????葡萄糖??????1-5%

蛋白胨?????0.1-0.5%??????????酵母膏?????0.1-0.5%

硫酸鎂?????0.1-0.5%??????????磷酸二氫鉀?0.01-0.05%

(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20～35℃溫度，搖瓶轉速為80～280r/min，pH?3～8條件下，震動培養7～15天；培養中當pH值降到2.5～4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20～35℃，發酵罐壓力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH?3～8，通氣量0.5～1.1vvm，攪拌速度100～280轉/分的條件，培養7～15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液制備火木層孔菌粗提物。

(3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2～1/5；?

(4)用體積百分比為60～95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2～8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60～90%，乙醇優選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優選為濃縮液體積的3-6倍；

(5)對步驟(4)所得提取液在50～70℃條件下，加熱1～2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5～1/10；

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。

然后從火木層孔菌粗提物中制備1,2-苯二酚，步驟如下：火木層孔菌粗提物→正相硅膠層析→氯仿與甲醇梯度洗脫→TLC檢測→正相硅膠層析→氯仿甲醇凝膠層析→TLC檢測→正相硅膠層析→TLC檢測→減壓蒸干→無色油狀物（1,2-苯二酚）。?

具體方法為：?

(1)制備火木層孔菌粗提物；

(2)將步驟（1）所得的沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液；

(3)將步驟（2）中最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；

(4)收集步驟（3）中的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿：甲醇=1:1溶解，進行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥；

(5)將步驟（4）中得到的產物進行再次進行正相硅膠層析,使用洗脫劑洗脫；

(6)收集步驟（5）得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為1,2-苯二酚。

優選的，提取步驟(2)中所述的硅膠為100-200目正相硅膠，層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇；?

提取步驟(3)中所述的硅膠用量為1-3倍體積，洗脫劑為石油醚與丙酮；

提取步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex?LH-20，洗脫劑為氯仿：甲醇=1:1～1：3；