[發明專利]火木層孔菌中環二肽C8在抗禽流感H5N1病毒上的應用

有效

• 申請號: 201310401670.X
• 申請日: 2013-09-06
• 公開（公告）號: CN103800333A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 趙晨;宋愛榮;孔超;黃芳;秦丹
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: A61K31/4985
• 分類號: A61K31/4985;A61P31/16;C07D487/04;A01G1/04
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技術領域

本發明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013?年8月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，?保藏編號為CGMCC?No.8108，分類名稱為火木層孔菌?Phellinus?igniarius，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。?

背景技術

????通常生物學中所指的環肽是指以氨基酸肽鍵形成的化合物，在植物化學中這一概念被擴大成以酰胺鍵形成的一類化合物，因此范圍被擴大至包括有機胺類和大環生物堿類，根據成環與否分為環肽和直鏈肽。?已報道的環肽類化合物具有多方面的生物活性，包括抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗瘧、安眠、抑制血小板聚集、降壓、抑制酪氨酸酶、抑制環氧化酶、抑制脂質過氧化酶、雌性激素樣、免疫抑制等生物活性。?

????由于環肽的前體-直鏈肽所包含的氨基酸的數目和種類的千差萬別，造成了環肽合成方法的多樣化。對某種直鏈肽表現出高效，快速縮合作用的試劑和方法對另外一種肽鏈就可能變得低效或無效。?

????一種環二肽具有抗菌等多種重要的生理活性，如今，未見到有抗情流感病毒活性的報到。?

發明內容

本發明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的一種環二肽C8。本發明首次公開了這種一種環二肽的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。?

本方法較一般化合物應用的優點在于：發現了該種一種環二肽C8的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。?

本發明的技術方案如下：?

首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是：

玉米淀粉????1-5%?????????????葡萄糖??????1-5%

蛋白胨?????0.1-0.5%??????????酵母膏?????0.1-0.5%

硫酸鎂?????0.1-0.5%??????????磷酸二氫鉀?0.01-0.05%

(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20～35℃溫度，搖瓶轉速為80～280r/min，pH?3～8條件下，震動培養7～15天；培養中當pH值降到2.5～4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20～35℃，發酵罐壓力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH?3～8，通氣量0.5～1.1vvm，攪拌速度100～280轉/分的條件，培養7～15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液制備火木層孔菌粗提物。

(3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2～1/5；?

(4)用體積百分比為60～95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2～8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60～90%，乙醇優選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優選為濃縮液體積的3-6倍；

(5)對步驟(4)所得提取液在50～70℃條件下，加熱1～2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5～1/10；

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。

然后從火木層孔菌粗提物中環二肽C8，步驟如下：火木層孔菌粗提物→正相硅膠層析→甲醇梯度洗脫→正相硅膠層析→甲醇凝膠→常壓反相制備→HPLC檢測→¹D-HNMR→環二肽C8。?

具體方法為：?

(1)制備火木層孔菌粗提物；

(2)將上述步驟（1）所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次；

(3)收集上述步驟（2）得到的最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫；

(4)將步驟（3）得到的產物進行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；

(5)收集洗脫液，適當合并，減壓蒸干，進行甲醇凝膠層析；

(6)將步驟（5）得到的產物進行常壓反相層析，洗脫劑為甲醇與水；

(7)HPLC檢測，減壓干燥，即為環二肽C8。

優選的，提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。?