[發明專利]一種基于氨基酸的煙草代謝組學中新鮮煙葉樣品質量的判別方法

有效

• 申請號: 201310401114.2
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN104422741A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 許國旺;張俊杰;路鑫;趙春霞;常玉瑋;趙燕妮;沈丹紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 劉陽

技術領域

本發明涉及分析化學領域，是一種判別煙草代謝組學研究所用的煙草鮮葉樣本質量是否滿足代謝組學研究需要的判別方法。

背景技術

植物代謝組學是通過考察植物受刺激或擾動后其代謝產物的變化或其隨時間的變化，來研究植物體系的一種技術。在代謝組學輪廓分析的流程中，典型樣本的采集是首要并且及其重要的步驟，獲得合格樣本，以真實客觀地反映樣本的代謝狀態，是代謝組學分析進行的基礎和前提。植物鮮葉樣本的采集，需要在低溫下淬滅以停止其生理活動以保證其停止在采樣時的代謝狀態，標準做法為采摘植物樣本后，錫紙包裹，置于-196℃液氮冷凍，用于煙草鮮葉分析或者凍干后用干粉樣本分析。在樣本采摘到分析前的這一段過程，需保證煙草鮮葉在液氮中保存且在液氮條件下研磨，否則會造成鮮葉的酶促褐變。

氨基酸是植物中重要的一類化合物，是構成蛋白質的結構單位，一些蛋白酶可調節植物的物質代謝。多數氨基酸在植物代謝網絡中是初生和次生代謝的樞紐，氨基酸代謝是植物代謝的關鍵環節。氨基酸進一步代謝產物包括核酸，酯，多酚，葉綠素，生物堿等重要物質。氨基酸的代謝作為氮代謝的起始部分，在協調碳氮代謝方面起重要作用，在煙草植株生長代謝過程中，碳氮代謝的協調決定了煙葉的質量和品質。另外，在植物蛋白質營養質量排序中，煙葉蛋白質居于首位。同一些主要作物如水稻、小麥、玉米、大豆蛋白質中必需氨基酸相比,煙草蛋白中的必需氨基酸含量較高，均高于國際糧農組織(FAO)制定的蛋白制品中必需氨基酸含量標準,其中酪氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸和亮氨酸超過該標準的1倍左右。

嚴重褐變的煙草鮮葉樣本，其顏色會由鮮綠變為褐色，但酶促褐變反應輕微的樣本僅通過觀察樣本外觀顏色深淺難以準確判別樣本是否正常。本專利首次提出采用谷氨酸與谷氨酰胺含量的比值鑒別煙草鮮葉的質量，為代謝組學研究的樣本質量判別提供依據。

發明內容

本發明提供了一種對煙草代謝組學研究中的煙草鮮葉樣本質量判別的方法。為了實現本發明目的，本發明所述的一種對代謝組學研究中的煙草鮮葉樣本質量進行判別的方法，其利用煙草鮮葉中谷氨酸與谷氨酰胺含量的比值對代謝組學研究中的煙草鮮葉質量進行判別。

通過檢測煙草鮮葉中谷氨酸與谷氨酰胺含量，計算其比值，對代謝組學研究中的煙草鮮葉樣本質量進行判別。

將煙草鮮葉中加入含內標的提取溶劑，提取后離心過濾，采用6-氨基喹啉-N-琥珀酰亞胺甲酯(AQC)衍生后，利用超高效液相色譜-單四級桿質譜（UPLC-SQDMS）進行分析，通過標準曲線計算得出谷氨酰胺和谷氨酸的含量。

所述內標為降纈氨酸，其含量為5mg/L，所述提取溶劑為含乙醇70%的水溶液；所述煙草鮮葉與含內標的提取溶劑按質量/體積比加入量為=35:1-3。

超高效液相色譜-單四級桿質譜（UPLC-SQDMS）的條件為：色譜柱Waters?UPLC?C18column；流動相A：20mM甲酸銨，0.5%甲酸，1%乙腈，98.5%水，流動相B：1.6%甲酸，98.4%乙腈（v/v）；流速：0.35mL/min；柱溫：55℃；進樣體積：1μL；進樣器溫度：15℃；洗脫梯度為：0-1.08min，0.1%-0.1%B；1.08-11.48min，0.1%-9.1%B；11.48-16.3min，9.1%-21.2%B；16.3-16.9min，21.2%-59.6%B；16.9-18.1min，59.6%-59.6%B；18.1-18.28min，59.6%-0.1%B，18.28-20min，0.1%-0.1%B；質譜方法：ESI正離子模式下，分段SIR掃描，毛細管電壓：3KV，錐孔電壓：30V，脫溶劑氣溫度：300℃，錐孔溫度：120℃，脫溶劑氣流量：650L/h，錐孔氣流量：50L/h。

所述煙草鮮葉是經-196℃液氮罐保存運輸，液氮冷凍研磨，凍干，-80℃冰箱保存待用。

以谷氨酸與谷氨酰胺含量的比值為指標，建立區分代謝組學正常樣本、部分褐化及褐化樣本的標準，即待測樣本中谷氨酸與谷氨酰胺比值在0.67以上的為合格樣本，用于煙草代謝組學分析；谷氨酸與谷氨酰胺比值在0.12以下的為變質的不合格樣本，谷氨酸與谷氨酰胺比值介于0.12與0.67之間為部分質變的不合格樣本。

本發明研究人員經過大量煙草鮮葉樣本的分析研究，發現煙草鮮葉如果發生酶促褐變等反應，其游離氨基酸的含量會發生較大變化，谷氨酸與谷氨酰胺含量的比值明顯降低，此類樣本將不能用于代謝組學分析。因此以谷氨酸與谷氨酰胺含量的比值作為一個標準對代謝組學研究中的煙草鮮葉樣本質量進行判別。