[發(fā)明專利]一種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310400493.3
• 申請(qǐng)日: 2013-08-31
• 公開（公告）號(hào): CN103451166A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉乃山;宋超龍;劉翠珍;劉振海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島康原藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/26
• 分類號(hào): C12N9/26
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及從新鮮動(dòng)物睪丸中提取玻璃酸酶的方法。

背景技術(shù)

玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動(dòng)物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時(shí)精子進(jìn)入卵子。也存在于精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細(xì)胞的溶酶體中。

玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42℃加熱60分鐘活力不損失；100℃加熱5分鐘，活力可保留80％。受熱失活后進(jìn)行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0.2％或0.5％阿拉伯膠或0.2％明膠保護(hù)。Fe²⁺、Cu²⁺對(duì)酶有可逆抑制作用，Pb²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺等對(duì)酶活性沒有明顯影響。硫酸軟骨素B(皮膚素)、硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對(duì)酶均有抑制作用，但可被0.15mol／L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。

藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無(wú)氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機(jī)溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料進(jìn)行提取制備。

國(guó)外50年代初已投入生產(chǎn)，并收載于英國(guó)和日本藥典中，商品名Rondas。我國(guó)1965年正式投入生產(chǎn)，從羊睪丸中提取，收入1977版中國(guó)藥典。王彥，周淑敏等曾在2002年15卷(1)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研究》的文章，較詳細(xì)的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎(chǔ)上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應(yīng)用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研究》的文章，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中玻璃酸酶的實(shí)驗(yàn)研究。但是關(guān)于從豬睪丸中提取玻璃酸酶的工藝，暫時(shí)還沒有相關(guān)記載。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法，采用酸液提取和硫酸銨鹽析得玻璃酸酶粗品，粗品再經(jīng)超濾、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品。具體步驟如下：

1.提取：

將豬睪丸除內(nèi)外皮層及付睪丸，絞成糜漿。稱取糜漿，按每1kg糜漿加酸液1.0-1.5L的比例，加酸液攪拌，浸出4小時(shí)后，將浸出液過濾，濾液調(diào)pH至3.2～4.0。

取濾渣，仍根據(jù)開始糜漿量加酸液，每1kg糜漿加酸液0.2-0.3L，加酸液攪拌1小時(shí)后，再次過濾，濾液調(diào)pH至3.2～4.0。

所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液，其中冰醋酸，1mol／L鹽酸，水的體積百分比為1-5∶10-20∶150-220，氯化鈉的濃度為0.10-0.20mol／L。

2.粗制：

合并步驟(1)中的兩次濾液，在攪拌下，以每1L加硫酸銨230-260克的比例，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置，過濾，留固體。量取濾液，在攪拌下，按1L濾液加硫酸銨280-310克的比例，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置，過濾，合并兩次固體，得粗品。

3.精制：

3.1超濾

粗品溶于水中，進(jìn)行超濾。

3.2熱原處理：

將超濾液離心20-30分鐘，轉(zhuǎn)速2700-3200r／min，過濾，將濾液放冰浴中冷卻，在濾液中加入磷酸三鈉(Na₃PO₄·12H₂O)溶液，在攪拌下，再緩緩加入醋酸鈣(Ca(CH₃COO)₂·H₂O)溶液，并調(diào)pH至8-9，離心，時(shí)間20分鐘～30分鐘，轉(zhuǎn)速2700-3200r／min。收集上清液，之后將上清液調(diào)pH至6.5～7.0。

以上所述：磷酸三鈉溶液的濃度為10質(zhì)量％-20質(zhì)量％，其加入量為濾液體積的5％-15％；醋酸鈣溶液的濃度為15質(zhì)量％-25質(zhì)量％，其加入量為濾液體積的5％-10％。

3.3凍干

將濾液冷凍干燥，即得玻璃酸酶精品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：