[發明專利]基于口蹄疫A型VP1蛋白及其單抗的競爭ELISA方法

有效

• 申請號: 201310399981.7
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103554234A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 熊毅;蔣家霞;馮淑萍;顏健華
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C07K14/09
• 分類號: C07K14/09;C07K16/10;C12N15/42;C12N15/70;G01N33/577
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

1.一種口蹄疫A型VP1蛋白，包括兩種不同表達方式得到的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2，其特征在于，口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2氨基酸序列均為SEQ?ID?NO:1所示。

2.一種制備權利要求1所述的口蹄疫A型VP1蛋白的方法，其特征在于，以口蹄疫病毒FMDV基因組為模板，利用一對克隆引物和一對表達引物進行PCR擴增得到FMDV-A-VP1基因，將FMDV-A-VP1基因分別與pET-32a、pGEX-6p-1質粒連接構建得到表達質粒PET-32a-VP1、pGEX-6p-1-VP1，再將表達質粒PET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1分別轉入原核表達宿主大腸桿菌BL21中誘導表達得到分別融合蛋白1和融合蛋白2，融合蛋白1和融合蛋白2分別經純化得到氨基酸序列均為SEQ?ID?NO:1所示的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2；所述一對克隆引物包括引物C1：5’-TACCAAATTACACGGGAA-3’，引物C2：5’-GACATGTCCTCCTGCATCTG-3’；

所述一對表達引物包括引物E1：5’-CCGGAATTCACCACCACTGTTGAGAACTACG-3’，引物E2：5’-?CCGCTCGAGTCATTACAGGAGTTGCTTTGCAGGTGC-3’。

3.根據權利要求2所述的制備口蹄疫A型VP1蛋白的方法，其特征在于，所述的PCR擴增過程中退火溫度為54.5~57.5℃；所述的融合蛋白純化為經過His和GST柱層析純化。

4.一種制備口蹄疫A型VP1蛋白單抗的方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟：

步驟a)動物免疫：利用表達質粒PET-32a-VP1誘導得到的口蹄疫A型VP1蛋白1免疫5~7周齡的BALB／c雌性小鼠，經過3次免疫后，篩選出免疫測定效價＞1:12800的小鼠；

步驟b)細胞融合：取步驟a)得到的免疫小鼠的脾細胞，與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，利用表達質粒pGEX-6p-1-VP1誘導得到的口蹄疫A型VP1蛋白2作為包被抗原，對融合后的細胞進行間接ELISA篩選得到雜交瘤細胞；

步驟c)單抗的大量克?。簩⒉襟Eb)得到的雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔中，飼養注射后的小鼠1~3周，收集腹部膨大的小鼠腹水，對腹水進行純化得到口蹄疫A型VP1蛋白單抗；

所述的口蹄疫A型VP1蛋白1、口蹄疫A型VP1蛋白2為不同表達方式得到的相同序列蛋白，兩者蛋白氨基酸序列均為SEQ?ID?NO:1所示。