[發(fā)明專利]基于口蹄疫A型VP1蛋白及其單抗的競爭ELISA方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310399981.7
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103554234A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設計）人: 熊毅;蔣家霞;馮淑萍;顏健華
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C07K14/09
• 分類號: C07K14/09;C07K16/10;C12N15/42;C12N15/70;G01N33/577
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

技術領域

本發(fā)明屬于動物免疫學檢測技術領域，特別是涉及一種口蹄疫A型VP1蛋白及其制備方法，以及一種基于制備得到的口蹄疫A型VP1蛋白及其單抗的競爭ELISA方法。

背景技術

口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的高傳染性且具有重要經(jīng)濟意義的動物疫病，感染牛、豬、綿羊、山羊和其他的偶蹄動物。動物感染口蹄疫后，口、蹄、乳頭等部位會出現(xiàn)水泡形成糜爛，發(fā)病的動物一般是呈良性經(jīng)過。口蹄疫雖然死亡率低，但是由于其發(fā)病率高幾乎達到100%，且傳播速度很快，制約了畜牧業(yè)的發(fā)展以及國家之間參與動物和動物產(chǎn)品的國際貿易，OIE將其列為A類動物疫病。

口蹄疫存在著七個血清型（O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和?Asia1）和80多個亞型，每個血清型中有各自的抗原性和流行特征，不存在交叉免疫，即免疫一種血清型疫苗不能抵抗另外一種血清型；各血清型中還有其不同的基因型，抗原性也存在一定程度的不同。這種多樣性主要由于病毒的高突變率和重組性，也給口蹄疫疾病的診斷、控制和根除帶來了困難。O型是全球范圍內最流行的血清型，遍及中東南亞國家；?Asia1開始只局限于亞洲，近年來已經(jīng)逐步入侵到了中東國家；A型抗原最具多樣性，相對其它血清型更容易發(fā)生重組，主要在亞洲、歐洲、非洲和拉丁美洲分布；南非1、2、3型（SAT1-3）主要在非洲流行。

我國自從1958年首次報道發(fā)生O、A、Asia-I這三種血清型的口蹄疫，其后偶爾有發(fā)生。A型口蹄疫在1964年從蘇聯(lián)傳入了新疆地區(qū)再次引起流行，而后沒有發(fā)生大規(guī)模的流行。直到2009年在湖北武漢暴發(fā)A型口蹄疫，這次流行的毒株根據(jù)口蹄疫VP1基因遺傳進化分析證實與2008-2009年在東南亞國家分離的毒株相似（泰國、馬來西亞），同屬于A/ASIA/Sea-97譜系；同年在中國的上海、山東、江蘇、廣西、貴州和新疆六個省也報道了A型口蹄疫的暴發(fā)，2010年在無口蹄疫非免疫地區(qū)的韓國也同樣出現(xiàn)了。Nick?J.?Knowles^[20]等報道近年來東南亞國家A型口蹄疫的流行繼O和Asia1型之后再次引起了東亞地區(qū)的暴發(fā)，口蹄疫這種跨國的傳播，使我國的口蹄疫疫情更為復雜，防疫工作更為嚴謹，對A型口蹄疫的研究應更為深入。廣西地處中國大陸的南端，與東南亞國家相鄰，東盟貿易區(qū)的自由化，面臨著入侵的威脅，這需要我們做好口蹄疫監(jiān)測和防控工作。

ELISA是enzyme?linked?immuno-sorbent?assay的縮寫，即酶連免疫吸附實驗，是當今口蹄疫抗體檢測的一個重要方法，該方法分為液相阻斷ELISA（LPB-ELISA），和固相競爭ELISA（SPC-ELISA）。其中SPC-ELISA以其高敏感性和高相關性，正逐漸成為主流的口蹄疫抗體檢測方法。但是SPC-ELISA的弱點是操作比較復雜，即使是有經(jīng)驗的操作人員也得需要4-5小時才能完成。目前對于口蹄疫方面的研究情況，如專利CN201110001730.X，該發(fā)明將口蹄疫抗體通過包被技術結合在ELISA板上，然后通過抗原-抗體結合反應將口蹄疫抗原牢固結合ELISA板孔內，經(jīng)穩(wěn)定劑處理和干燥后進行真空包裝，最后置低溫長期保存，當需要檢測口蹄疫抗體時，可以將該ELISA板直接用于實驗，但該發(fā)明的ELISA板長期保存，將對于該檢測方法產(chǎn)生一定的誤差，并且不能將O、A、Asia-I這三種血清型的口蹄疫區(qū)分開，不利于推廣使用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有口蹄疫A型血清的檢測技術存在檢測成本高、檢測操作麻煩、結果誤差大等不足，提供一種基于口蹄疫A型VP1蛋白及其單抗的競爭ELISA方法，發(fā)明涉及到A型口蹄疫蛋白VP1單克隆抗體的制備，及其運用于病原、抗體的檢測和疫苗的研制等；建立了單抗競爭ELISA的方法來檢測A型抗體，形成A型口蹄疫免疫監(jiān)測技術平臺。

本發(fā)明實現(xiàn)的技術方案為：一種口蹄疫A型VP1蛋白，包括兩種不同表達方式得到的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2，口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2氨基酸序列均為SEQ?ID?NO:1所示。