[發(fā)明專利]一種CD3抗原及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310399169.4
• 申請(qǐng)日: 2013-09-05
• 公開（公告）號(hào): CN103467605A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張敬;王瑞;劉楊;周鵬飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢友芝友生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/85;G01N33/68
• 代理公司: 北京市百倫律師事務(wù)所 11433
• 代理人: 周紅力;姜瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種CD3抗原及其制備方法和用途。?

背景技術(shù)

CD3是人免疫T細(xì)胞表面標(biāo)記抗原，是由四種亞基（subunit）組成的六聚體，通過電荷吸附作用圍繞在T細(xì)胞受體（T?cell?receptor，TCR）周圍。CD3的四種亞基分別為CD3ε（CD3E），CD3δ（CD3D），CD3γ（CD3G），CD3ζ（CD3Z），均為跨膜蛋白；并且CD3E與CD3D形成二聚體、CD3E與CD3G形成二聚體（heterodimer），它們的胞外區(qū)通常可以作為抗CD3抗體的識(shí)別靶位點(diǎn)。?

CD3E?ECD為CD3E的胞外結(jié)構(gòu)域（extra-cellular?domain），CD3D?ECD為CD3D的胞外結(jié)構(gòu)域，CD3G?ECD為CD3G的胞外結(jié)構(gòu)域。?

OKT3作為第一個(gè)商業(yè)化的抗CD3抗體，其靶點(diǎn)為CD3E和CD3G二聚體的胞外區(qū)。OKT3不僅能夠結(jié)合CD3，還具有激活T細(xì)胞的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)CD3E和CD3G形成了二聚體才具有免疫原性，能被OKT3結(jié)合，而單獨(dú)的CD3E或CD3G均無法被OKT3結(jié)合。?

UCHT1是一個(gè)常用的抗CD3抗體，既能夠識(shí)別CD3E和CD3D二聚體的ECD部分，也能識(shí)別CD3E和CD3G二聚體的ECD部分，而單獨(dú)的CD3E?ECD、CD3D?ECD和CD3G?ECD均無法被UCHT1所識(shí)別。?

目前CD3抗原的制備方法有將CD3E?ECD與CD3G?ECD融合（CD3E-G?ECD?fusion）；將CD3E?ECD與CD3D?ECD融合（CD3E-D?ECD?fusion）；將CD3E、CD3G和CE3D三種亞基的ECD與免疫球蛋白IgG1的Fc片段融合（CD3E/G/D-Fc）；或者在融合蛋白的C端添加Flag標(biāo)簽（CD3E/G/D-Fc-Flag）或His標(biāo)簽（CD3E/G/D-Fc-His）等。其中，CD3E-G?ECD融合蛋白和CD3E-D?ECD融合蛋白都采用原核表達(dá)，存在于包涵體中，純化后需要進(jìn)行復(fù)性，也有CD3E/G/D?ECD分別用原核表達(dá)，純化后將CD3E和CD3G或CD3D等比例混?合進(jìn)行復(fù)性；原核表達(dá)CD3抗原雖然產(chǎn)量高，但是增加了復(fù)性步驟，最后得到的具有免疫原性的CD3只有原來的10%甚至更低。?

CD3E/G/D-Fc重組融合蛋白在293細(xì)胞中表達(dá)，具有免疫原性，能夠被OKT3和UCHT1識(shí)別，但是在該抗原的制備過程中也存在有CD3E-Fc、CD3D-Fc和CD3G-Fc所形成的同源二聚體（homodimer）以及CD3D-Fc-CD3G-Fc異二聚體等雜質(zhì)蛋白，因此形成異二聚體的效率一般在50%以下。雖然該抗原的制備方法通過采用在不同的Fc片段C端攜帶不同的標(biāo)簽的技術(shù)可以得到純度大于90%的抗原，但是純化過程中，需要進(jìn)行至少三步親和層析，損失也比較多，導(dǎo)致抗原的收率低于50%。?

由于目前CD3抗原及其制備方法中存在的上述缺點(diǎn)，有必要開發(fā)一種新的異二聚體形成效率高的通過真核表達(dá)系統(tǒng)制備的異二聚體的CD3抗原。?

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明提出了一種可以解決上述問題的或至少能部分解決上述問題的一種CD3抗原，其中，所述CD3抗原包括：Fc片段、CD3的ε亞基CD3E的胞外結(jié)構(gòu)域CD3E?ECD，以及CD3的δ亞基CD3D的胞外結(jié)構(gòu)域CD3D?ECD或CD3的γ亞基CD3G的胞外結(jié)構(gòu)域CD3G?ECD；?

其中，所述Fc片段由Fc1片段和Fc2片段通過二硫鍵形成；?

其中，所述抗原為由兩個(gè)融合蛋白形成的異二聚體，在第一個(gè)融合蛋白中，CD3E?ECD的C端與Fc1的N端連接，構(gòu)成融合蛋白CD3E?ECD-Fc1，在第二個(gè)融合蛋白中，CD3D?ECD的C端與Fc2的N端連接，構(gòu)成融合蛋白CD3D?ECD-Fc2，或者CD3G?ECD的C端與Fc2的N端連接，構(gòu)成融合蛋白CD3G?ECD-Fc2；?

其中，F(xiàn)c1片段和Fc2片段的氨基酸序列均為將SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列進(jìn)行2個(gè)或3個(gè)氨基酸的點(diǎn)突變獲得。?

本發(fā)明還提供了一種CD3抗原的制備方法，所述方法包括：?

（1）分別獲得重組載體e和重組載體d，或者分別獲得重組載體e和重組載體g；?

（2）對(duì)所述重組載體e和d，或者重組載體e和g進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得突變重組載體em和dm，或者獲得突變重組載體em和gm；?

（3）在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)染em和dm；或者轉(zhuǎn)染em和gm；?