[發明專利]一種利用微生物液態發酵生產彈性蛋白酶酶制劑的方法

在審

• 申請號: 201310398828.2
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103627689A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 高兆建;張桂英;張建萍;侯進慧;陳尚龍;張從省
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N9/66
• 分類號: C12N9/66;C12R1/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓然

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別是涉及一種利用微生物液態發酵生產彈性蛋白酶酶制劑的方法。

背景技術

彈性蛋白酶是一種以分解不溶性彈性蛋白為特征的蛋白水解酶，主要存在于動物胰臟中，在皮膚、主動脈、血小板和白血球中也有分布，同時，在微生物類群中也廣有分布，細菌、放線菌、真菌中都能分泌胞外彈性蛋白酶。彈性蛋白酶可使結締組織蛋白質中的彈性蛋白消化分解，包括肽鍵結合的、酰胺結合的和酯結合的進行加水分解。彈性蛋白酶具有明顯的β-脂蛋白酶作用，能活化磷酯酶A，降低血清膽固醇，改善血清脂質，降低血漿膽固醇及第密度脂蛋白、甘油三酯，升高密度脂蛋白、阻止脂質向動脈壁沉積和增大動脈的彈性，具有抗動脈粥樣硬化及抗脂肪肝作用。在醫學臨床主要用于治療高血脂癥，防止動脈粥樣硬化、脂肪肝。由于彈性蛋白酶能夠專一降解結締組織中堅韌的彈性纖維組分，所以當其他蛋白與彈性蛋白共存時，此酶優先對彈性蛋白水解，因此彈性蛋白酶也可以作為理想的肉類嫩化劑用于食品加工業。所以根據彈性蛋白酶的特性，彈性蛋白酶不僅在醫藥上有其應用價值，而且在食品、日用化工工業上有著廣闊的前景和商業價值。目前，彈性蛋白酶大都是通過從動物的胰臟中獲取得方法來制備的，這種方法產酶量低，保藏性不好，過程較為復雜，而且成本高。如何克服現有技術的不足已成為當今生物工程技術領域亟待解決的重點難題之一。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術的不足而提供一種利用微生物液態發酵生產彈性蛋白酶酶制劑的方法，本發明具有提高產彈性蛋白酶的效率、增強彈性蛋白酶的活性和降低生產成本的優點，適用于大批量生產彈性蛋白酶。

根據本發明提出的一種利用微生物液態發酵生產彈性蛋白酶酶制劑的方法，其特征在于選用地衣芽孢桿菌(Baclicus?lincheniformis)ELAT4(CGMCC5700)作為彈性蛋白酶生產的菌種，經地衣芽孢桿菌菌種活化、種子液制備、發酵液培養、深層液體通風發酵和彈性蛋白酶酶制劑成品制備步驟，而制得彈性蛋白酶酶制劑，具體步驟如下：

步驟一，菌種活化：將保藏的地衣芽孢桿菌在菌種活化培養基上劃線兩次，均在37℃培養箱中培養18-24h，第二次劃線以第一次劃線得到的單菌落為菌種。然后從第二次劃線的平板上挑選單菌落接入液體菌種活化培養基或固體菌種活化培養基，培養溫度37℃、時間180-200r／min、搖瓶培養OD₆₀₀至1D₆₀₀；

步驟二，種子液制備：從活化好的液體試管中接種菌液到種子培養基，培養溫度35-37℃、時間160-180r／min、搖床震蕩培養18-24h，成為種子液；過平板劃線法，用接種環從保存的菌種斜面中接種到菌種活化固體培養基中，放置37℃培養箱中培養18-24h，然后再次從活化的固體培養基中挑取單菌落接種到另一個菌種活化固體培養基上，進行二次活化，培養條件：37℃培養箱中培養18-24h；從平板上挑選單菌落接入含5mL液體菌種活化培養基或固體菌種活化培養基的試管中，將試管置于搖床，培養溫度37℃、時間180-200r／min、搖瓶培養OD₆₀₀至1D₆₀₀；

步驟三，搖瓶發酵液培養：將培養好的種子培養液以2％-8％(v／v)的接種量，接種至250ml三角瓶中，160-180r／min搖床震蕩培養；搖瓶發酵培養基發酵前6-10h控制溫度為35-37℃，10h后切換至26-30℃并保持到發酵結束；發酵0-10h過程中控制發酵液pH7.0-7.5，10h后至發酵結束過程中將pH保持在7.5-8.5；

步驟四，深層液體通風發酵：發酵罐滅菌前，按照1∶1000的比例加入消泡劑，發酵過程中的罐壓維持0.04Mpa；接種量3-6％(v／v)、發酵罐初始發酵培養基自發酵初始至發酵14h，通風量0.55vvm；發酵14-24h，通風量0.75vvm；發酵25h至發酵結束，通風0.6vvm；發酵0-30h，溫度34-36℃；發酵30h后溫度25-30℃；發酵過程pH7.5-8.0；發酵達到25h補加濃度為100g／L的葡萄糖溶液80ml；發酵達到30h，再次補加濃度100g／L的葡萄糖100ml；發酵達到35h，補加濃度為100g／L的豆餅粉乳濁液150ml；

步驟五，彈性蛋白酶酶制劑成品制備：

(1)、發酵液除菌：發酵液4℃、8000r/min離心10min去除菌體；