[發明專利]一種利用微生物液態發酵生產彈性蛋白酶酶制劑的方法

在審

• 申請號: 201310398828.2
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103627689A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 高兆建;張桂英;張建萍;侯進慧;陳尚龍;張從省
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N9/66
• 分類號: C12N9/66;C12R1/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓然

1.一種利用微生物液態發酵生產彈性蛋白酶酶制劑的方法，其特征在于選用地衣芽孢桿菌(Baclicus?lincheniformis)?ELAT4?（CGMCC?5700）作為彈性蛋白酶生產的菌種，經地衣芽孢桿菌菌種活化、種子液制備、發酵液培養、深層液體通風發酵和彈性蛋白酶酶制劑成品制備步驟，而制得彈性蛋白酶酶制劑，具體步驟如下：

步驟一，菌種活化：將保藏的地衣芽孢桿菌在菌種活化培養基上劃線兩次，均在37℃培養箱中培養18-24h，第二次劃線以第一次劃線得到的單菌落為菌種，然后從第二次劃線的平板上挑選單菌落接入液體菌種活化培養基或固體菌種活化培養基，培養溫度37℃、時間180-200r/min、搖瓶培養OD₆₀₀至lD₆₀₀；

步驟二，種子液制備：從活化好的液體試管中接種菌液到種子培養基，培養溫度35-37℃、搖床震蕩頻率160-180r/min、搖床震蕩培養18-24h，成為種子液；平板劃線法，用接種環從保存的菌種斜面中接種到菌種活化固體培養基中，放置37℃培養箱中培養18-24h，然后再次從活化的固體培養基中挑取單菌落接種到另一個菌種活化固體培養基上，進行二次活化，在37℃培養箱中培養18-24h；從平板上挑選單菌落接入含5mL液體菌種活化培養基或固體菌種活化培養基的試管中，將試管置于搖床，培養溫度37℃、時間180-200r/min、搖瓶培養OD₆₀₀至lD₆₀₀；

步驟三，搖瓶發酵液培養：將培養好的種子培養液以2％-8%(v/v)的接種量，接種至250ml三角瓶中，160-180r/min搖床震蕩培養；搖瓶發酵培養基發酵前6-10h控制溫度為35-37℃，10h后切換至26-30℃并保持到發酵結束；發酵0-10h過程中控制發酵液pH7.0-7.5，10h后至發酵結束過程中將pH保持在7.5-8.5；其中，pH保持為采用滴加酸堿溶液的方法；

步驟四，深層液體通風發酵：發酵罐滅菌前，按照l:1000的比例加入消泡劑，發酵過程中的罐壓維持0.04Mpa；接種量3-6％(v/v)、發酵罐初始發酵培養基自發酵初始至發酵14h，通風量0.55vvm；發酵14-24h，通風量0.75vvm；發酵25h至發酵結束，通風0.6vvm；發酵0-30h，溫度34-36℃；發酵30h后溫度25-30℃；發酵過程pH7.5-8.0；發酵達到25h補加濃度為100g/L的葡萄糖溶液80ml；發酵達到30h，再次補加濃度100g/L的葡萄糖100ml；發酵達到35h，補加濃度為100g/L的豆餅粉乳濁液150ml；

步驟五，彈性蛋白酶酶制劑成品制備：

（1）、發酵液除菌：發酵液4℃?、8000r/min離心10min去除菌體；

（2）、超濾濃縮：第一次采用截留分子質量為60kDa的超濾膜過濾，保留濾出液；第二次用20kDa的超濾膜過濾，濾液濃縮3-5倍，保存截留液；

（3）、硫酸銨鹽析：將超濾后的濾液調節pH至6.5，向濾液中加入硫酸銨至飽和度25%，4℃靜置8-10h，然后在4℃下8000r/min離心機離心10min，去除底部沉淀，收集上清液；調節上清液pH8.5，添加硫酸銨至飽和度70%，4℃靜置8-10h后冷凍并離心收集沉淀蛋白；0.02mol/L、pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液溶解沉淀，并充分透析；

（4）、真空冷凍干燥：將透析后的酶液20kDa的超濾膜超濾，濃縮6-10倍，加入保護劑1-2%海藻酸鈉、2-3%蔗糖、3-5%麥芽糊精、0.1-0.25%山梨酸鉀和0.1-0.4%苯甲酸鈉；經充分分散后，-20℃冷凍8-10h、真空度30-50Pa，溫度-35°C以下、冷凍15-18h，再經粉碎即制得彈性蛋白酶酶制劑成品。