[發明專利]一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株及其篩選方法

無效

• 申請號: 201310398796.6
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103509742A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 高兆建;張桂英;陳宏偉;孫會剛;張從省;王東星
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓然

1.一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株，其特征在于所述菌株ELAT4的分類命名為地衣芽孢桿菌(Baclicus?lincheniformis)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2012年2月10日，保藏號為：CGMCC?No.?5700。

2.根據權利要求1所述的地衣芽孢桿菌菌株，其特征在于所述菌株ELAT4（CGMCC?No.?5700）具有以下特性：

(1)菌落形態：菌落呈灰白色，較粘稠、易挑起，表面濕潤；

(2)菌體形態：菌體產耐熱芽孢，孢囊不膨大，革蘭氏染色陽性，顯微鏡下呈單個菌體，直桿狀，兩端鈍圓，芽孢橢圓中生；

(3)生長條件：最低溫度18℃，最高溫度55℃，最適生長溫度34-37℃；

(4)生理生化特性：V.P試驗陽性，吲哚試驗陰性，甲基紅試驗陽性，硝酸鹽還原陽性，過氧化氫酶試驗陽性，明膠液化陽性，淀粉水解陽性，酪素水解陽性。

3.基于權利要求1所述的一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株的篩選方法，其特征在于依次包括如下具體步驟?：

步驟一，土樣采樣：土樣取自牛羊屠宰場的受污染物；

步驟二，菌株富集培養：稱取土樣2g，放入盛有100ml無菌水的錐形瓶中，搖床上160r/min震蕩30min，取3-4ml渾濁液接入富集培養基，條件37℃、160r/min、振蕩培養3d，其中：

富集培養基（g/v）為：1%彈性蛋白、0.1%KH₂PO₄、0.2%NaNO₃、0.05%KCL、0.1%NH₄Cl和0.01%MgSO₄?7H₂O，每100mL培養基中加入0.1mL濃縮微量元素，在pH7.5、溫度121℃條件下滅菌20?min；其中：濃縮微量元素為：2g/L?CaCl₂、0.1g/L?MnSO₄?4H₂O、0.6g/L?FeSO₄?7H₂O、0.4g/L?ZnSO₄?7H₂O、2g/L?CoCl₂?6H₂O和1g/L?NaCl；?

步驟三，菌株初篩：采用平板稀釋分離法，取0.2ml富集培養樣品涂布于固體牛肉膏蛋白胨平板上平板上，培養48h后，將平板上長出的單菌落再點接于彈性蛋白初篩分離培養基上，37℃培養48-72d，挑選水解彈性蛋白所形成的透明圈直徑與菌落徑之比值較大的菌株；其中：彈性蛋白初篩分離培養基為：0.5g彈性蛋白、0.1g酵母膏、0.1g葡萄糖、0.1g?K2HPO4、0.05g?KH2PO4、0.01g?MgSO4?7H2O、蒸餾水100ml和1.5g瓊脂粉，在?pH7.0、溫度121℃的條件下蒸汽滅菌15min；?

步驟四，菌株分離純化：將初篩出來的菌株，接種于牛肉膏蛋白胨培養基平板上劃線，再置于34-37℃恒溫培養箱中培養48h，重復劃線培養三次以上，連續多次在顯微鏡下觀察到形態單一的菌體則認為菌株已純化；

步驟五、菌株復篩：初篩得到的菌株經斜面活化后接種于裝有種子培養基的搖瓶中，培養基裝液量30mL/250mL三角瓶，培養溫度34-37℃，搖床轉速160-180r/min，培養16-24h后將培養好的菌液按2-8%的接種量接種于裝有發酵培養基的搖瓶中，三角瓶容量250mL，裝量20-40mL，培養溫度34-37℃，搖床轉速160-180r/min，發酵時間48-72h。

4.根據權利要求3所述的一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株的篩選方法，其特征在于步驟五所述的種子培養基為：0.4g牛肉膏、0.8g蛋白胨、0.1g酵母粉、0.5g葡萄糖、0.5g?NaCl、0.1g?KH₂PO₄、0.04g?MgSO₄?7H₂O和100ml蒸餾水，在?pH7.0-8.0、溫度121℃的條件下蒸汽滅菌20min。

5.根據權利要求3或4所述的一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株的篩選方法，其特征在于步驟五所述的發酵培養基為：0.5g葡萄糖、0.4g彈性蛋白、1g干酪素、0.4g蛋白胨、0.5g酵母粉、0.5g?NaCl、0.1g?KH₂PO₄、0.04g?MgSO₄?7H₂O和蒸餾水100ml，在?pH7.0、溫度121℃的條件下蒸汽滅菌20min。